VirWaTest, en punkt-for-anvendelse metode til påvisning af virus i vandprøver
Summary
Her præsenterer vi VirWaTest, som er en enkel, overkommelig og bærbar metode til koncentration og påvisning af vira fra vandprøver på tidspunktet for brug.
Abstract
Vira, der udskilles af mennesker og dyr, kan forurene vandkilder og udgøre en risiko for menneskers sundhed, når dette vand bruges til drikke, vanding af fødevarer, vask osv. Den klassiske fækale bakterie indikator kontrollerer ikke altid for tilstedeværelsen af virale patogener, så påvisning af virale patogener og virale indikatorer er relevant for at vedtage foranstaltninger til risikoreduktion, især i humanitære scenarier og i områder hvor der hyppigt anvendes vandbårne virus udbrud.
På nuværende tidspunkt er flere kommercielle tests, der gør det muligt at kvantificere fækale indikatorbakterier (FIB), tilgængelige til testning på brugsstedet. Sådanne kommercielle tests er dog ikke tilgængelige til påvisning af vira. Påvisning af vira i miljømæssige vandprøver kræver at koncentrere flere liter i mindre mængder. Når det er koncentreret, er påvisning af vira desuden afhængig af metoder som nukleinsyre ekstraktion og molekylær detektion (f. eks. polymerasekæde reaktion [PCR]-baserede assays) af de virale genomer.
Den beskrevne metode gør det muligt at koncentrationen af vira fra 10 L vandprøver, samt udvinding af virale nukleinsyre på tidspunktet for brug, med enkle og bærbare udstyr. Dette gør det muligt at afprøve vandprøver på anvendelsesstedet for flere vira og er nyttige i humanitære scenarier, samt i enhver sammenhæng, hvor et udstyret laboratorium ikke er til rådighed. Alternativt, metoden tillader koncentrering vira til stede i vandprøver og forsendelse af koncentrat til et laboratorium ved stuetemperatur til yderligere analyse.
Introduction
I de første faser af en humanitær nødsituation er adgang til rent vandforsyning, sanitet og hygiejne afgørende for de berørte. Derfor er overvågning af vandkvaliteten en prioritet for at forebygge vandbårne udbrud. Det er velkendt, at forurenet vand ofte er oprindelsen af sygdomme, men det er ofte vanskeligt at bestemme kilderne til virus udbrud såsom hepatitis E virus (HEV), selv med tilgængeligheden af konventionelle laboratoriemetoder. Kontrollen af vandkvaliteten er baseret på kvantificeringen af FIB1,2,3,4. Det er imidlertid blevet udførligt dokumenteret, at der ikke er nogen sammenhæng mellem fraværet af FIB og tilstedeværelsen af virale vandbårne patogener som rotavirus (RoV), norovirus (NoV), eller HEV5,6. Anvendelse af vandkvalitets kriterierne baseret på FIB kan således resultere i en undervurdering af risiciene i forbindelse med tilstedeværelsen af vandbårne virale patogener. Overvågning af indikator vira, såsom humane adenoviruser (hadv), eller specifikke patogener ville være nyttigt til at definere eksponeringen for virale patogener og identificere den potentielle kilde til infektion med mennesker7,8, 9,10 og validering af effektiviteten af sanitets foranstaltninger11.
Indtil nu har påvisning af vira i disse scenarier været baseret på faglært personale og kompleks logistik. VirWaTest (virwatest.org) har til formål at udvikle en enkel, overkommelig og bærbar metode til koncentration og efterfølgende påvisning af vira fra vandprøver på brugsstedet.
Virus koncentrationen er baseret på princippet om organisk flokkulering af 10 L vandprøver, hvormed vira genvindes i mindre volumener12,13. Partikler er indsamlet og føjet til en buffer, der af virus og forhindrer nukleinsyre syrer fra nedbrydning, når de opbevares ved stuetemperatur i ikke mere end 2 uger.
Nukleinsyre ekstraktionsmetoden er baseret på brugen af magnetiske partikler, som nukleinsyrer får adsorbet. De kan overføres fra en vaskebuffer til en anden og endelig ind i elueringsbufferen ved hjælp af en magnetisk pipette, som partiklerne binder til. De opnåede virale nukleinsyre-suspensioner kan sendes til et referencelaboratorium, hvor detektionsmetoden kan udføres ved hjælp af molekylære metoder baseret på PCR. For hver nukleinsyre ekstraktion testes to forskellige mængder for at udelukke enzymatisk hæmning, der stammer fra prøven. Alternativt kan PCR-tests med minimal udstyrs tilgængelighed køres på brugsstedet. Hele processen er konstrueret til at blive udført uafhængigt af en strømforsyning (figur 1).
En kvantitativ PCR-analyse til påvisning af HAdV, der udskilles af mennesker og findes i spildevands prøver i høje koncentrationer, er blevet tilpasset til at blive kørt på anvendelsesstedet. HAdV anvendes som humane fækale virale indikatorer. En PCR til kvantificering af MS2 bakteriophage er også blevet tilpasset, da MS2 anvendes i VirWaTest som proceskontrol. Metoden kan tilpasses til påvisning af eventuelle virus af interesse.
Efter udvikling, den VirWaTest metode er blevet anvendt af brugerne i to forskellige indstillinger i Republikken central Afrika (RCA) og Ecuador, giver feedback om anvendelsen af protokollen i reelle situationer.
Til vores viden, dette er den første procedure, der giver mulighed for koncentration og påvisning af virus på tidspunktet for brug, uafhængigt af enhver strømforsyning, stort udstyr, og frysning/køling betingelser. Det anbefales at indsamle to replikater af hver vandprøve for at opnå solide resultater.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den VirWaTest metode gør det muligt at koncentrationen af vira og nukleinsyre ekstraktion fra vandprøver på det tidspunkt, hvor de ikke-erfarne brugere bruger. Det er en overkommelig, hurtig og enkel protokol. Koncentrationen er baseret på princippet om organisk flokkulering ved hjælp af skummetmælk, hvormed de lave pH-og høje ledningsevneforhold gør skummetmælks proteiner samlet i partikler, hvor virusser adsorberer til. Når partikler sediment, er det let at samle dem, hvilket gør det muligt at koncentrere 10…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
VirWaTest var et forskningsprojekt finansieret af HIF (humanitært innovationsfond) program for ELHRA (styrkelse af lærings & forskning for humanitær bistand). Forfatterne anerkender de vaske hold, der venligt samarbejdede i denne undersøgelse. Analysen af prøverne i Ecuador blev finansieret af Oxfam Ecuador og Dirección de Investigaciones de la Universidad de Las Americas (AMB. BRT. 17.01). S. Bofill-Mas er en Serra-Hunter-stipendiat ved universitetet i Barcelona.
Materials
| 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (ROX) | Solis BioDyne | 08-14-00001 | Includes Solis Biodyne's 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (qPCR Mix), 50 Reactions |
| 8-Microtube Strips with Caps | dD Biolab | 840637 | Low Profile, Thin Walls, Adapted for Quantitative and Qualitative PCR |
| Aquagenx CBT E. coli Kit | Aquagenx, LLC | ECCBT10 | 10 Tests per Kit |
| Batteries and Power Adapters for Magnetic Stirrer | GenIUL | 900011674 | Includes 12V car power adapter |
| Bucket Support | GenIUL | 900011648 | Aluminium support |
| Bucket, 10 L | Cater4You | 10LTR | Polypropilene, Tamperproof, Clear color |
| Centrifuge Tube, 50 mL | LabBox | CTSP-E50-050 | Polypropylene, Sterile, Graduated, With Skirt |
| Citric Acid 1-Hydrate, 500 g | PanReac AppliChem | 1410181211 | Pure, Pharma Grade, 1 Kilogram |
| Clear PET Bottle | LabBox | FPET-500-088 | Clear Color, PET, Cap Not Included |
| Difco Skim Milk, 500 g | Becton Dickinson | 232100 | Dehydrated |
| DNA/RNA Shield, 250 mL | Zymo Research | R1100-250 | DNA/RNA Preservation Medium, 250 mL |
| Easy9 Pipette Controller | LabBox | EAS9-001-001 | 0.3 μm filter, Pipettes from 0.1 to 100 mL, Autoclavable silicone pipette holder |
| Eppendorf Tube, 0.5 mL | Eppendorf | 0030121023 | Polypropilene, Safe-Lock |
| Eppendorf Tube, 2 mL | Eppendorf | 0030120094 | Polypropilene, Safe-Lock |
| Eppendorf Tube, 5 mL | dD Biolab | 999542 | Polypropylene, Sterile, Graduated |
| Ethanol 96% V/V, 1 L | Panreac AppliChem | 361085-1611 | For UV, IR and HPLC |
| Laboratory Tweezers | LabBox | FORS-007-002 | Thin, Curved End, L= 120 mm |
| Magnetic Stirrer | GenIUL | 900017000 | Battery-powered |
| Marker | dD Biolab | 929203 | Black, Extra fine Tip, Water Resistant, Fast Drying, For Plastic and Glassware |
| Micro Rota-Rack for Microtubes | dD Biolab | 37782 | 4 Modules, L x W x H= 208 x 100 x 100 mm |
| Mini8 Real-Time PCR Cycler | Coyote Biosciences, China | Mini-8 | Portable, Works with 12V Power Supplies or External Batteries, Two channels, Capacity for 8 Tubes |
| NucliSens Lysis Buffer | Biomerieux | 200292 | Reagents for up to 48 Isolations, Store at Ambient Temperature |
| Open Tip Serological Pipette, 10 mL | Deltalab | 900136N | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| PE Screw Cap PP28 | LabBox | TP28-004-020 | For PET Bottles |
| pH Indicator Strip | LabBox | WSPH-001-001 | Range pH 2.8 to pH 4.4, 50 Strips per Pack |
| Plastic Test Tube | Quimikals | 300913 | Includes Cap |
| Polyethylene Pasteur Pipette | LabBox | PIPP-003-500 | Graduated, 7 mL Overall Volume, Non-Sterile |
| Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 150 mL | Deltalab | 409726 | Screw cap, Sterile, graduated up to 100 mL |
| Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 60 mL | Deltalab | 409526G | Screw cap, Sterile, Graduated up to 50 mL |
| Powder Powder Detergent | – | – | Regular Powder Soap for washing clothes |
| Power Cables for Magnetic Stirrer | GenIUL | 900011692 | Connection between batteries and magnetic stirrers |
| QuickPick Magnetic Tool | BioNobile | 24001 | Hand-held tool for magnetic particles |
| QuickPick Tips in Box | BioNobile | 24296 | RNase-Free, Autoclaved, 96 Units |
| QuickPick XL gDNA Magnetic Particles | BioNobile | SN51100 | 3.2 mL |
| Sea Salts | Sigma-Aldrich | S9883-500G | An artificial salt mixture closely resembling the composition of the dissolved salts of ocean water |
| Silicone Tubing | LabBox | SILT-006-005 | Roll of 5 Meters, Inner ø x Outer ø= 6 x 10 mm |
| Sodium Hydroxide Pellets, 98.5 – 100.5% | VWR Chemicals | 28244295 | Pellets, 1 Kg |
| Solar Rotary Platform | SOL-EXPERT Group | 70020 | Acrylic Plate, 10 RPM, Supports up to 300 Grams |
| SOLIScript 1-step Probe Kit | Solis BioDyne | 08-57-00250 | Includes Solis Biodyne's 5x One-Step Probe Mix (qPCR Mix) and 40x One-Step SOLIScript Mix (Reverse Transcriptase Enzyme), 250 Reactions |
| SPEEDTOOLS RNA Virus Extraction Kit | BioTools | 21.141-4197 | Includes BioTools's BAW Buffer (Washing Buffer 1), BAV3 Buffer (Washing Buffer 2 and 3) and BRE Buffer (Elution Buffer). |
| SpinBar Octhaedral Stirring Magnet | dD Biolab | 045926 | Pivot Ring, L x ø = 38 x 8 mm, Blue |
| Tape-End Serological Pipette, 10 mL | Deltalab | PN10E1 | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| Tape-End Serological Pipette, 50 mL | Deltalab | 900043 | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| Termi-DNA-Tor – Nucleic Acid Remover | BioTools | 22001-4291 | Remover of nucleic acids, bacteria, fungi and mycoplasma from material and surfaces, 450 mL |
| Water Molecular Biology Reagent, 1L | Sigma-Aldrich | W4502-1L | Nuclease and Protease Free, 0.1 μm Filtered |
| Whirl-Pak Bag, 540 mL | Deltalab | 200361 | Stable bottom |
| Zip Lock Plain Bag | LabBox | BZIP-080-100 | Polyethylene, L x W= 120 x 80 mm |
References
- The Sphere Project. . The Sphere Project: Humanitarian Charter and Minimum Standards in Humanitarian Response. , (2011).
- Bartram, J., et al. . Water Safety Plan Manual:Step-by-step risk management for drinking-water suppliers. , (2009).
- World Health Organization. . Guidelines for Drinking-water Quality. , (2011).
- World Health Organization. . 25 Years Progress on Sanitation and Drinking Water. , (2015).
- Girones, R., et al. Molecular detection of pathogens in water – The pros and cons of molecular techniques. Water Research. 44 (15), 4325-4339 (2010).
- Rodriguez-Manzano, J., et al. Standard and new fecal indicators and pathogens in sewage treatment plants, microbiological parameters for improving the control of reclaimed water. Water Science and Technology. 66 (12), 2517-2523 (2012).
- Puig, M., et al. Detection of adenoviruses and enteroviruses in polluted waters by nested PCR amplification. Applied and Environmental Microbiology. 60 (8), 2963-2970 (1994).
- Carter, M. J. Enterically infecting viruses: Pathogenicity, transmission and significance for food and waterborne infection. Journal of Applied Microbiology. 98 (6), 1354-1380 (2005).
- Bofill-Mas, S., Pina, S., Girones, R. Documenting the epidemiologic patterns of polyomaviruses in human populations by studying their presence in urban sewage. Applied and Environmental Microbiology. 66 (1), 238-245 (2000).
- Bofill-Mas, S., et al. Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices. Applied and Environmental Microbiology. 72 (12), 7894-7896 (2006).
- Rames, E., Roiko, A., Stratton, H., Macdonald, J. Technical aspects of using human adenovirus as a viral water quality indicator. Water Research. 96, 308-326 (2016).
- Calgua, B., et al. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. Journal of Virological Methods. 153 (2), 79-83 (2008).
- Bofill-Mas, S., et al. Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses. Journal of Visualized Experiments. 58, 5-9 (2011).
- International Organization for Standardization. . ISO 10705-1:1995: Water quality – Detection and enumeration of bacteriophages – Part 1: Enumeration of F-specific RNA bacteriophages. , (1995).
- Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report. Applied and Environmental Microbiology. 68 (9), 4523-4533 (2002).
- Pecson, B. M., Martin, L. V., Kohn, T. Quantitative PCR for determining the infectivity of bacteriophage MS2 upon inactivation by heat, UV-B radiation, and singlet oxygen: Advantages and limitations of an enzymatic treatment to reduce false-positive results. Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5544-5554 (2009).
- Calgua, B., Barardi, C. R. M., Bofill-Mas, S., Rodriguez-Manzano, J., Girones, R. Detection and quantitation of infectious human adenoviruses and JC polyomaviruses in water by immunofluorescence assay. Journal of Virological Methods. 171 (1), 1-7 (2011).
- Bofill-Mas, S., et al. Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses. Journal of Visualized Experiments. (58), e2820 (2011).
- Gonzales-Gustavson, E., et al. Characterization of the efficiency and uncertainty of skimmed milk flocculation for the simultaneous concentration and quantification of water-borne viruses, bacteria and protozoa. Journal of Microbiological Methods. 134, 46-53 (2017).
