וירוטסט, נקודת שימוש לאיתור וירוסים בדגימות מים
Summary
כאן אנו מציגים את VirWaTest, המהווה שיטה פשוטה, במחיר סביר ונייד לריכוז ואיתור של וירוסים מדגימות המים בנקודת השימוש.
Abstract
וירוסים מופרשים על ידי בני אדם ובעלי חיים עלולים לזהם מקורות מים ולהוות סיכון לבריאות האדם כאשר מים זה משמש לשתייה, השקיה במזון, כביסה, וכו ‘. מחוון חיידקים בצואה קלאסית לא תמיד לבדוק את הנוכחות של פתוגנים ויראלי כך גילוי פתוגנים נגיפי אינדיקטורים נגיפי הוא רלוונטי כדי לאמץ מדדים של הקלה בסיכון, במיוחד בתרחישים הומניטאריים ובתחומים שבו התפרצויות ויראליות המועברות במים תכופים.
כיום, מספר בדיקות מסחריות המאפשרות כימות של חיידקים אינדיקטור צואה (פרפור) זמינים לבדיקה בנקודת השימוש. עם זאת, בדיקות מסחריות כאלה אינן זמינות לאיתור וירוסים. איתור וירוסים בדגימות מים סביבתיים דורש ריכוז של כמה ליטרים לתוך כרכים קטנים יותר. יתר על כן, לאחר מרוכז, זיהוי של וירוסים מסתמך על שיטות כגון הפקת חומצת גרעין וזיהוי מולקולרי (למשל, תגובת שרשרת פולימראז [PCR] מבוסס assays) של genomes ויראלי.
השיטה המתוארת כאן מאפשרת ריכוז של וירוסים מ 10 דגימות מים L, כמו גם את החילוץ של חומצות גרעין נגיפי בנקודת השימוש, עם ציוד פשוט ונייד. זה מאפשר בדיקות של דגימות מים בנקודת השימוש עבור מספר וירוסים והוא שימושי בתרחישים הומניטאריים, כמו גם בכל הקשר שבו מעבדה מצויד אינה זמינה. לחילופין, השיטה מאפשרת התמקדות בווירוסים המצויים בדגימות מים והובלת הריכוז למעבדה בטמפרטורת החדר לצורך ניתוח נוסף.
Introduction
במהלך השלבים הראשונים של החירום ההומניטרי, גישה לאספקת מים נקיים, תברואה והיגיינה הם קריטיים להישרדות של אלה המושפעים. לכן, הניטור איכות המים הוא בעדיפות כדי למנוע התפרצויות המועברות במים. זה ידוע כי מים מזוהמים הוא לעתים קרובות מקור המחלות, אבל לעתים קרובות קשה לקבוע את המקורות של התפרצויות ויראלי כגון וירוס הפטיטיס (הכבד), אפילו עם זמינות של שיטות מעבדה קונבנציונאלי. השליטה על איכות המים מבוססת על כימות השקר1,2,3,4. עם זאת, הוא תועד בהרחבה כי אין מתאם בין העדר פרפור ונוכחות של פתוגנים מים ויראלי כגון רוטוירוס (רוב), norovirus (NoV), או מת5,6. לכן, שימוש בקריטריון איכות המים המבוססת על פרפור עלול לגרום להערכת הסיכונים הקשורים לנוכחות של פתוגנים ויראלי מים. מעקב אחר וירוסי מחוון, כגון אדנוירוסים אנושיים (hadv), או פתוגנים ספציפיים יהיה מועיל להגדיר את החשיפה לפתוגנים נגיפי וזיהוי המקור הפוטנציאלי של זיהום אנושי7,8, 9,10 ובאימות היעילות. של אמצעי התברואה11
עד עכשיו, גילוי של וירוסים בתרחישים אלה הסתמך על צוות מיומן ולוגיסטיקה מורכבת. VirWaTest (virwatest.org) מיועדת לפיתוח של שיטה פשוטה, במחיר נוח ונייד לריכוז ואיתור בעקבות וירוסים מדגימות המים בנקודת השימוש.
הריכוז וירוס מבוסס על העיקרון של לוקליזציה אורגנית של 10 L דגימות מים, אשר וירוסים משוחזרים בכרכים קטנים יותר12,13. Flocs נאספים והוסיף מאגר כי lyses וירוסים ומונע את חומצות גרעין מן השפלה כאשר הם מאוחסנים בטמפרטורת החדר עבור לא יותר מ 2 שבועות.
שיטת החילוץ חומצת גרעין מבוססת על השימוש חלקיקים מגנטיים שאליהם חומצות גרעין לקבל adsorbed. הם יכולים להיות מועברים ממאגר כביסה אחד למשנהו ולבסוף לתוך מאגר להתחמק על ידי שימוש בצנרת מגנטית אשר החלקיקים לצרף. נגיפי חומצות גרעין ויראלי שהושגו ניתן לשלוח למעבדת התייחסות שבה ניתן לבצע איתור באמצעות שיטות מולקולריות המבוססות על ה-PCR. עבור כל הפקת חומצת גרעין, שתי כמויות שונות נבדקו כדי לשלול עיכוב אנזימטי מקורו על ידי המדגם. לחילופין, עם זמינות מינימלית לציוד, ניתן להפעיל בדיקות PCR בנקודת השימוש. התהליך כולו נועד להתבצע באופן עצמאי מספק כוח (איור 1).
שיטת ה-PCR הכמותית לזיהוי האדב, המופרשת על-ידי בני אדם ונמצאה בדגימות שפכים בריכוזים גבוהים, הותאמה להפעלה בנקודת השימוש. HAdV משמשות כאינדיקטורים ויראליים אנושיים. ה-PCR לקוונפיקציה של MS2 בקטביאג כבר הותאם מאז MS2 משמש ב-VirWaTest כבקרת תהליך. ניתן להתאים אישית את השיטה לאיתור כל וירוס מעניין.
לאחר פיתוח, השיטה VirWaTest הוחלה על ידי המשתמשים בשתי הגדרות שונות ברפובליקת מרכז אפריקה (RCA) ואקוודור, מתן משוב על יישום הפרוטוקול במצבים אמיתיים.
לידיעתך, זהו הנוהל הראשון המאפשר ריכוז ואיתור של וירוסים בנקודת השימוש, ללא תלות בכל ספק כוח, ציוד גדול, ותנאי הקפאה/קירור. מומלץ לאסוף שתי משכפל של כל דגימת מים כדי להשיג תוצאות חזקות.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה VirWaTest מאפשרת ריכוז של וירוסים וחומצות גרעין החילוץ מדגימות מים בנקודת השימוש על ידי משתמשים לא מנוסים. זהו פרוטוקול זול, מהיר ופשוט. הריכוז מבוסס על העיקרון של החיסון האורגני באמצעות חלב, שדרכו מצבם של ה-pH הנמוכים והמוליכות הגבוהה הופכים את חלבוני החלב הניגנב לתוך הרמה הנמוכה ביותר ש…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
וירוטסט היה פרויקט מחקר במימון תוכנית HIF (קרנות חדשנות הומניטארית) של ELHRA (שיפור הלמידה & מחקר לסיוע הומניטארי). המחברים מכירים בצוותי השטיפה שיתפו פעולה באדיבות במחקר זה. הניתוח של דגימות באקוודור המומן על ידי אוקספם אקוודור והבימוי הטוב ביותר באוניברסיטה דה לאס אמריקאס (AMB). BRT. 17.01). S. Bofill-Mas הוא בחור סרה-צייד באוניברסיטת ברצלונה.
Materials
| 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (ROX) | Solis BioDyne | 08-14-00001 | Includes Solis Biodyne's 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (qPCR Mix), 50 Reactions |
| 8-Microtube Strips with Caps | dD Biolab | 840637 | Low Profile, Thin Walls, Adapted for Quantitative and Qualitative PCR |
| Aquagenx CBT E. coli Kit | Aquagenx, LLC | ECCBT10 | 10 Tests per Kit |
| Batteries and Power Adapters for Magnetic Stirrer | GenIUL | 900011674 | Includes 12V car power adapter |
| Bucket Support | GenIUL | 900011648 | Aluminium support |
| Bucket, 10 L | Cater4You | 10LTR | Polypropilene, Tamperproof, Clear color |
| Centrifuge Tube, 50 mL | LabBox | CTSP-E50-050 | Polypropylene, Sterile, Graduated, With Skirt |
| Citric Acid 1-Hydrate, 500 g | PanReac AppliChem | 1410181211 | Pure, Pharma Grade, 1 Kilogram |
| Clear PET Bottle | LabBox | FPET-500-088 | Clear Color, PET, Cap Not Included |
| Difco Skim Milk, 500 g | Becton Dickinson | 232100 | Dehydrated |
| DNA/RNA Shield, 250 mL | Zymo Research | R1100-250 | DNA/RNA Preservation Medium, 250 mL |
| Easy9 Pipette Controller | LabBox | EAS9-001-001 | 0.3 μm filter, Pipettes from 0.1 to 100 mL, Autoclavable silicone pipette holder |
| Eppendorf Tube, 0.5 mL | Eppendorf | 0030121023 | Polypropilene, Safe-Lock |
| Eppendorf Tube, 2 mL | Eppendorf | 0030120094 | Polypropilene, Safe-Lock |
| Eppendorf Tube, 5 mL | dD Biolab | 999542 | Polypropylene, Sterile, Graduated |
| Ethanol 96% V/V, 1 L | Panreac AppliChem | 361085-1611 | For UV, IR and HPLC |
| Laboratory Tweezers | LabBox | FORS-007-002 | Thin, Curved End, L= 120 mm |
| Magnetic Stirrer | GenIUL | 900017000 | Battery-powered |
| Marker | dD Biolab | 929203 | Black, Extra fine Tip, Water Resistant, Fast Drying, For Plastic and Glassware |
| Micro Rota-Rack for Microtubes | dD Biolab | 37782 | 4 Modules, L x W x H= 208 x 100 x 100 mm |
| Mini8 Real-Time PCR Cycler | Coyote Biosciences, China | Mini-8 | Portable, Works with 12V Power Supplies or External Batteries, Two channels, Capacity for 8 Tubes |
| NucliSens Lysis Buffer | Biomerieux | 200292 | Reagents for up to 48 Isolations, Store at Ambient Temperature |
| Open Tip Serological Pipette, 10 mL | Deltalab | 900136N | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| PE Screw Cap PP28 | LabBox | TP28-004-020 | For PET Bottles |
| pH Indicator Strip | LabBox | WSPH-001-001 | Range pH 2.8 to pH 4.4, 50 Strips per Pack |
| Plastic Test Tube | Quimikals | 300913 | Includes Cap |
| Polyethylene Pasteur Pipette | LabBox | PIPP-003-500 | Graduated, 7 mL Overall Volume, Non-Sterile |
| Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 150 mL | Deltalab | 409726 | Screw cap, Sterile, graduated up to 100 mL |
| Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 60 mL | Deltalab | 409526G | Screw cap, Sterile, Graduated up to 50 mL |
| Powder Powder Detergent | – | – | Regular Powder Soap for washing clothes |
| Power Cables for Magnetic Stirrer | GenIUL | 900011692 | Connection between batteries and magnetic stirrers |
| QuickPick Magnetic Tool | BioNobile | 24001 | Hand-held tool for magnetic particles |
| QuickPick Tips in Box | BioNobile | 24296 | RNase-Free, Autoclaved, 96 Units |
| QuickPick XL gDNA Magnetic Particles | BioNobile | SN51100 | 3.2 mL |
| Sea Salts | Sigma-Aldrich | S9883-500G | An artificial salt mixture closely resembling the composition of the dissolved salts of ocean water |
| Silicone Tubing | LabBox | SILT-006-005 | Roll of 5 Meters, Inner ø x Outer ø= 6 x 10 mm |
| Sodium Hydroxide Pellets, 98.5 – 100.5% | VWR Chemicals | 28244295 | Pellets, 1 Kg |
| Solar Rotary Platform | SOL-EXPERT Group | 70020 | Acrylic Plate, 10 RPM, Supports up to 300 Grams |
| SOLIScript 1-step Probe Kit | Solis BioDyne | 08-57-00250 | Includes Solis Biodyne's 5x One-Step Probe Mix (qPCR Mix) and 40x One-Step SOLIScript Mix (Reverse Transcriptase Enzyme), 250 Reactions |
| SPEEDTOOLS RNA Virus Extraction Kit | BioTools | 21.141-4197 | Includes BioTools's BAW Buffer (Washing Buffer 1), BAV3 Buffer (Washing Buffer 2 and 3) and BRE Buffer (Elution Buffer). |
| SpinBar Octhaedral Stirring Magnet | dD Biolab | 045926 | Pivot Ring, L x ø = 38 x 8 mm, Blue |
| Tape-End Serological Pipette, 10 mL | Deltalab | PN10E1 | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| Tape-End Serological Pipette, 50 mL | Deltalab | 900043 | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| Termi-DNA-Tor – Nucleic Acid Remover | BioTools | 22001-4291 | Remover of nucleic acids, bacteria, fungi and mycoplasma from material and surfaces, 450 mL |
| Water Molecular Biology Reagent, 1L | Sigma-Aldrich | W4502-1L | Nuclease and Protease Free, 0.1 μm Filtered |
| Whirl-Pak Bag, 540 mL | Deltalab | 200361 | Stable bottom |
| Zip Lock Plain Bag | LabBox | BZIP-080-100 | Polyethylene, L x W= 120 x 80 mm |
References
- The Sphere Project. . The Sphere Project: Humanitarian Charter and Minimum Standards in Humanitarian Response. , (2011).
- Bartram, J., et al. . Water Safety Plan Manual:Step-by-step risk management for drinking-water suppliers. , (2009).
- World Health Organization. . Guidelines for Drinking-water Quality. , (2011).
- World Health Organization. . 25 Years Progress on Sanitation and Drinking Water. , (2015).
- Girones, R., et al. Molecular detection of pathogens in water – The pros and cons of molecular techniques. Water Research. 44 (15), 4325-4339 (2010).
- Rodriguez-Manzano, J., et al. Standard and new fecal indicators and pathogens in sewage treatment plants, microbiological parameters for improving the control of reclaimed water. Water Science and Technology. 66 (12), 2517-2523 (2012).
- Puig, M., et al. Detection of adenoviruses and enteroviruses in polluted waters by nested PCR amplification. Applied and Environmental Microbiology. 60 (8), 2963-2970 (1994).
- Carter, M. J. Enterically infecting viruses: Pathogenicity, transmission and significance for food and waterborne infection. Journal of Applied Microbiology. 98 (6), 1354-1380 (2005).
- Bofill-Mas, S., Pina, S., Girones, R. Documenting the epidemiologic patterns of polyomaviruses in human populations by studying their presence in urban sewage. Applied and Environmental Microbiology. 66 (1), 238-245 (2000).
- Bofill-Mas, S., et al. Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices. Applied and Environmental Microbiology. 72 (12), 7894-7896 (2006).
- Rames, E., Roiko, A., Stratton, H., Macdonald, J. Technical aspects of using human adenovirus as a viral water quality indicator. Water Research. 96, 308-326 (2016).
- Calgua, B., et al. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. Journal of Virological Methods. 153 (2), 79-83 (2008).
- Bofill-Mas, S., et al. Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses. Journal of Visualized Experiments. 58, 5-9 (2011).
- International Organization for Standardization. . ISO 10705-1:1995: Water quality – Detection and enumeration of bacteriophages – Part 1: Enumeration of F-specific RNA bacteriophages. , (1995).
- Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report. Applied and Environmental Microbiology. 68 (9), 4523-4533 (2002).
- Pecson, B. M., Martin, L. V., Kohn, T. Quantitative PCR for determining the infectivity of bacteriophage MS2 upon inactivation by heat, UV-B radiation, and singlet oxygen: Advantages and limitations of an enzymatic treatment to reduce false-positive results. Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5544-5554 (2009).
- Calgua, B., Barardi, C. R. M., Bofill-Mas, S., Rodriguez-Manzano, J., Girones, R. Detection and quantitation of infectious human adenoviruses and JC polyomaviruses in water by immunofluorescence assay. Journal of Virological Methods. 171 (1), 1-7 (2011).
- Bofill-Mas, S., et al. Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses. Journal of Visualized Experiments. (58), e2820 (2011).
- Gonzales-Gustavson, E., et al. Characterization of the efficiency and uncertainty of skimmed milk flocculation for the simultaneous concentration and quantification of water-borne viruses, bacteria and protozoa. Journal of Microbiological Methods. 134, 46-53 (2017).
