VirWaTest, et punkt-av-bruk metode for påvisning av virus i vann prøver
Summary
Her presenterer vi VirWaTest, som er en enkel, rimelig og bærbar metode for konsentrasjon og påvisning av virus fra vann prøver på bruks punktet.
Abstract
Virus som skilles ut av mennesker og dyr kan forurense vannkilder og utgjøre en risiko for menneskers helse når dette vannet brukes til drikking, mat vanning, vasking, etc. Den klassiske avføring bakterier indikatoren ikke alltid se etter tilstedeværelsen av virale patogener så påvisning av virale patogener og viral indikatorer er relevant for å vedta tiltak for risikoreduksjon, spesielt i humanitære scenarier og i områder virus utbrudd er hyppige.
I dag, flere kommersielle tester slik at kvantifisering av avføring indikator bakterier (LØGN) er tilgjengelig for testing på det punktet av bruk. Men slike kommersielle tester er ikke tilgjengelig for påvisning av virus. Påvisning av virus i miljøet vann prøver krever konsentrere flere liter i mindre volumer. Videre, når konsentrert, er påvisning av virus avhengig av metoder som nukleinsyre syre utvinning og molekylær deteksjon (f. eks, polymerase kjedere reaksjon [PCR]-baserte analyser) av viral genomer.
Metoden beskrevet her tillater konsentrasjonen av virus fra 10 L vann prøver, samt utvinning av viral nukleinsyre syrer på bruksstedet, med enkelt og bærbart utstyr. Dette gjør at testing av vann prøver på bruksstedet for flere virus og er nyttig i humanitære scenarier, samt i enhver sammenheng der et utstyrt laboratorium ikke er tilgjengelig. Alternativt kan metoden konsentrere virus som finnes i vann prøver og frakt av konsentrat til et laboratorium ved romtemperatur for videre analyse.
Introduction
I løpet av de første fasene av en humanitær nødssituasjon er tilgang til rent vannforsyninger, sanitær og hygiene avgjørende for overlevelse av de berørte. Derfor er overvåking av vannkvaliteten en prioritet for å hindre vannbaserte utbrudd. Det er velkjent at forurenset vann er ofte opprinnelsen til sykdommer, men det er ofte vanskelig å fastslå kildene til viral utbrudd som hepatitt E-virus (HEV), selv med tilgjengeligheten av konvensjonelle laboratorie metoder. Kontroll av vannkvaliteten er basert på kvantifisering av løgn1,2,3,4. Imidlertid har det vært omfattende dokumentert at det er ingen sammenheng mellom fraværet av liten løgn og tilstedeværelsen av viral vannbaserte patogener som rotavirus (RoV), Norovirus (NoV), eller Hev5,6. Således, ved hjelp av vannkvalitet kriterier basert på LØGN kan resultere i en undervurdering av risiko forbundet med tilstedeværelsen av vannbaserte virale patogener. Overvåking av indikator virus, slik som Human adenoviruses (HAdV), eller bestemte patogener vil være nyttig i å definere eksponering for virale patogener og identifisere den potensielle kilden til menneskelig infeksjon7,8, 9,10 og i å validere effekten av sanitær tiltak11.
Inntil nå, var påvisning av virus i disse scenariene avhengig av dyktige medarbeidere og komplekse logistikk. VirWaTest (virwatest.org) er rettet mot utvikling av en enkel, rimelig og bærbar metode for konsentrasjon og påfølgende deteksjon av virus fra vann prøver på bruksstedet.
Viruset konsentrasjonen er basert på prinsippet om organiske flokk ule Rings av 10 L vann prøver, der virus utvinnes i mindre volumer12,13. Flocs samles og legges til en buffer som analyser virusene og hindrer at nukleinsyre syrer forringes når de oppbevares ved romtemperatur i ikke mer enn 2 uker.
Den nukleinsyre syre utvinnings metoden er basert på bruk av magnetiske partikler som nukleinsyre syrer får adsorberes. De kan overføres fra en vaskebuffer til en annen og til slutt inn i eluering buffer ved hjelp av en magnetisk pipette som partiklene feste. Viral nukleinsyre syre suspensjoner innhentet kan sendes til et referanse laboratorium der påvisning kan utføres ved hjelp av molekylære metoder basert på PCR. For hver nukleinsyre syre ekstraksjon testes to forskjellige mengder for å utelukke enzymatisk hemming av prøven. Med minimum utstyrs tilgjengelighet kan også PCR-tester kjøres på bruksstedet. Hele prosessen er utformet for å utføres uavhengig av en strømforsyning (figur 1).
En kvantitativ PCR-analyse for å oppdage HAdV, utskilles av mennesker og funnet i avløpsvann prøver i høye konsentrasjoner, har blitt tilpasset for å kjøres på bruksstedet. HAdV brukes som menneskelige avføring viral indikatorer. En PCR for kvantifisering av MS2 bakteriofag er også tilpasset siden MS2 brukes i VirWaTest som prosesskontroll. Metoden kan tilpasses for påvisning av virus av interesse.
Etter utviklingen har VirWaTest-metoden blitt brukt av brukerne i to forskjellige innstillinger i Republikken Sentral-Afrika (RCA) og Ecuador, og gir tilbakemelding om anvendelsen av protokollen i virkelige situasjoner.
Til vår kunnskap, er dette den første fremgangsmåten som gjør at konsentrasjonen og påvisning av virus på bruksstedet, uavhengig av strømforsyning, stort utstyr, og frysing/kjøling forhold. Det anbefales å samle to replikerer av hver vannprøve for å oppnå robuste resultater.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den VirWaTest metoden gjør konsentrasjonen av virus og nukleinsyre syre utvinning fra vann prøver på det punktet av bruk av ikke-erfarne brukere. Det er en rimelig, rask og enkel protokoll. Konsentrasjonen er basert på prinsippet om organiske flokk ule Rings med skummet melk, der den lave pH og høy ledningsevne forhold gjør skummet melkeproteiner samlet inn flocs virusene adsorbere til. Når flocs sediment, er det lett å samle dem, noe som gjør det mulig å konsentrere 10 L vann, mens tradisjonelle ultracentrifug…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
VirWaTest var et forskningsprosjekt finansiert av HIF (humanitære Innovasjons fond) program for ELHRA (styrking læring & forskning for humanitær bistand). Forfatterne erkjenner WASH lagene som vennlig samarbeidet i denne studien. Analysen av prøvene i Ecuador ble finansiert av Oxfam Ecuador og Dirección de Investigaciones de la Universidad de Las Americas (AMB. BRT. 17.01). S. Bofill-mas er en Serra-Hunter stipendiat ved Universitetet i Barcelona.
Materials
| 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (ROX) | Solis BioDyne | 08-14-00001 | Includes Solis Biodyne's 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (qPCR Mix), 50 Reactions |
| 8-Microtube Strips with Caps | dD Biolab | 840637 | Low Profile, Thin Walls, Adapted for Quantitative and Qualitative PCR |
| Aquagenx CBT E. coli Kit | Aquagenx, LLC | ECCBT10 | 10 Tests per Kit |
| Batteries and Power Adapters for Magnetic Stirrer | GenIUL | 900011674 | Includes 12V car power adapter |
| Bucket Support | GenIUL | 900011648 | Aluminium support |
| Bucket, 10 L | Cater4You | 10LTR | Polypropilene, Tamperproof, Clear color |
| Centrifuge Tube, 50 mL | LabBox | CTSP-E50-050 | Polypropylene, Sterile, Graduated, With Skirt |
| Citric Acid 1-Hydrate, 500 g | PanReac AppliChem | 1410181211 | Pure, Pharma Grade, 1 Kilogram |
| Clear PET Bottle | LabBox | FPET-500-088 | Clear Color, PET, Cap Not Included |
| Difco Skim Milk, 500 g | Becton Dickinson | 232100 | Dehydrated |
| DNA/RNA Shield, 250 mL | Zymo Research | R1100-250 | DNA/RNA Preservation Medium, 250 mL |
| Easy9 Pipette Controller | LabBox | EAS9-001-001 | 0.3 μm filter, Pipettes from 0.1 to 100 mL, Autoclavable silicone pipette holder |
| Eppendorf Tube, 0.5 mL | Eppendorf | 0030121023 | Polypropilene, Safe-Lock |
| Eppendorf Tube, 2 mL | Eppendorf | 0030120094 | Polypropilene, Safe-Lock |
| Eppendorf Tube, 5 mL | dD Biolab | 999542 | Polypropylene, Sterile, Graduated |
| Ethanol 96% V/V, 1 L | Panreac AppliChem | 361085-1611 | For UV, IR and HPLC |
| Laboratory Tweezers | LabBox | FORS-007-002 | Thin, Curved End, L= 120 mm |
| Magnetic Stirrer | GenIUL | 900017000 | Battery-powered |
| Marker | dD Biolab | 929203 | Black, Extra fine Tip, Water Resistant, Fast Drying, For Plastic and Glassware |
| Micro Rota-Rack for Microtubes | dD Biolab | 37782 | 4 Modules, L x W x H= 208 x 100 x 100 mm |
| Mini8 Real-Time PCR Cycler | Coyote Biosciences, China | Mini-8 | Portable, Works with 12V Power Supplies or External Batteries, Two channels, Capacity for 8 Tubes |
| NucliSens Lysis Buffer | Biomerieux | 200292 | Reagents for up to 48 Isolations, Store at Ambient Temperature |
| Open Tip Serological Pipette, 10 mL | Deltalab | 900136N | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| PE Screw Cap PP28 | LabBox | TP28-004-020 | For PET Bottles |
| pH Indicator Strip | LabBox | WSPH-001-001 | Range pH 2.8 to pH 4.4, 50 Strips per Pack |
| Plastic Test Tube | Quimikals | 300913 | Includes Cap |
| Polyethylene Pasteur Pipette | LabBox | PIPP-003-500 | Graduated, 7 mL Overall Volume, Non-Sterile |
| Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 150 mL | Deltalab | 409726 | Screw cap, Sterile, graduated up to 100 mL |
| Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 60 mL | Deltalab | 409526G | Screw cap, Sterile, Graduated up to 50 mL |
| Powder Powder Detergent | – | – | Regular Powder Soap for washing clothes |
| Power Cables for Magnetic Stirrer | GenIUL | 900011692 | Connection between batteries and magnetic stirrers |
| QuickPick Magnetic Tool | BioNobile | 24001 | Hand-held tool for magnetic particles |
| QuickPick Tips in Box | BioNobile | 24296 | RNase-Free, Autoclaved, 96 Units |
| QuickPick XL gDNA Magnetic Particles | BioNobile | SN51100 | 3.2 mL |
| Sea Salts | Sigma-Aldrich | S9883-500G | An artificial salt mixture closely resembling the composition of the dissolved salts of ocean water |
| Silicone Tubing | LabBox | SILT-006-005 | Roll of 5 Meters, Inner ø x Outer ø= 6 x 10 mm |
| Sodium Hydroxide Pellets, 98.5 – 100.5% | VWR Chemicals | 28244295 | Pellets, 1 Kg |
| Solar Rotary Platform | SOL-EXPERT Group | 70020 | Acrylic Plate, 10 RPM, Supports up to 300 Grams |
| SOLIScript 1-step Probe Kit | Solis BioDyne | 08-57-00250 | Includes Solis Biodyne's 5x One-Step Probe Mix (qPCR Mix) and 40x One-Step SOLIScript Mix (Reverse Transcriptase Enzyme), 250 Reactions |
| SPEEDTOOLS RNA Virus Extraction Kit | BioTools | 21.141-4197 | Includes BioTools's BAW Buffer (Washing Buffer 1), BAV3 Buffer (Washing Buffer 2 and 3) and BRE Buffer (Elution Buffer). |
| SpinBar Octhaedral Stirring Magnet | dD Biolab | 045926 | Pivot Ring, L x ø = 38 x 8 mm, Blue |
| Tape-End Serological Pipette, 10 mL | Deltalab | PN10E1 | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| Tape-End Serological Pipette, 50 mL | Deltalab | 900043 | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| Termi-DNA-Tor – Nucleic Acid Remover | BioTools | 22001-4291 | Remover of nucleic acids, bacteria, fungi and mycoplasma from material and surfaces, 450 mL |
| Water Molecular Biology Reagent, 1L | Sigma-Aldrich | W4502-1L | Nuclease and Protease Free, 0.1 μm Filtered |
| Whirl-Pak Bag, 540 mL | Deltalab | 200361 | Stable bottom |
| Zip Lock Plain Bag | LabBox | BZIP-080-100 | Polyethylene, L x W= 120 x 80 mm |
References
- The Sphere Project. . The Sphere Project: Humanitarian Charter and Minimum Standards in Humanitarian Response. , (2011).
- Bartram, J., et al. . Water Safety Plan Manual:Step-by-step risk management for drinking-water suppliers. , (2009).
- World Health Organization. . Guidelines for Drinking-water Quality. , (2011).
- World Health Organization. . 25 Years Progress on Sanitation and Drinking Water. , (2015).
- Girones, R., et al. Molecular detection of pathogens in water – The pros and cons of molecular techniques. Water Research. 44 (15), 4325-4339 (2010).
- Rodriguez-Manzano, J., et al. Standard and new fecal indicators and pathogens in sewage treatment plants, microbiological parameters for improving the control of reclaimed water. Water Science and Technology. 66 (12), 2517-2523 (2012).
- Puig, M., et al. Detection of adenoviruses and enteroviruses in polluted waters by nested PCR amplification. Applied and Environmental Microbiology. 60 (8), 2963-2970 (1994).
- Carter, M. J. Enterically infecting viruses: Pathogenicity, transmission and significance for food and waterborne infection. Journal of Applied Microbiology. 98 (6), 1354-1380 (2005).
- Bofill-Mas, S., Pina, S., Girones, R. Documenting the epidemiologic patterns of polyomaviruses in human populations by studying their presence in urban sewage. Applied and Environmental Microbiology. 66 (1), 238-245 (2000).
- Bofill-Mas, S., et al. Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices. Applied and Environmental Microbiology. 72 (12), 7894-7896 (2006).
- Rames, E., Roiko, A., Stratton, H., Macdonald, J. Technical aspects of using human adenovirus as a viral water quality indicator. Water Research. 96, 308-326 (2016).
- Calgua, B., et al. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. Journal of Virological Methods. 153 (2), 79-83 (2008).
- Bofill-Mas, S., et al. Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses. Journal of Visualized Experiments. 58, 5-9 (2011).
- International Organization for Standardization. . ISO 10705-1:1995: Water quality – Detection and enumeration of bacteriophages – Part 1: Enumeration of F-specific RNA bacteriophages. , (1995).
- Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report. Applied and Environmental Microbiology. 68 (9), 4523-4533 (2002).
- Pecson, B. M., Martin, L. V., Kohn, T. Quantitative PCR for determining the infectivity of bacteriophage MS2 upon inactivation by heat, UV-B radiation, and singlet oxygen: Advantages and limitations of an enzymatic treatment to reduce false-positive results. Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5544-5554 (2009).
- Calgua, B., Barardi, C. R. M., Bofill-Mas, S., Rodriguez-Manzano, J., Girones, R. Detection and quantitation of infectious human adenoviruses and JC polyomaviruses in water by immunofluorescence assay. Journal of Virological Methods. 171 (1), 1-7 (2011).
- Bofill-Mas, S., et al. Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses. Journal of Visualized Experiments. (58), e2820 (2011).
- Gonzales-Gustavson, E., et al. Characterization of the efficiency and uncertainty of skimmed milk flocculation for the simultaneous concentration and quantification of water-borne viruses, bacteria and protozoa. Journal of Microbiological Methods. 134, 46-53 (2017).
