VirWaTest, en Point-of-use metod för detektion av virus i vattenprover
Summary
Här presenterar vi VirWaTest, som är en enkel, prisvärd och portabel metod för koncentration och detektion av virus från vattenprover vid tidpunkten för användning.
Abstract
Virus som utsöndras av människor och djur kan förora vattenkällor och utgöra en risk för människors hälsa när detta vatten används för att dricka, mat bevattning, tvättning, etc. Den klassiska fekal bakterie indikatorn kontrollerar inte alltid förekomsten av virala patogener, så upptäckten av virala patogener och virus indikatorer är relevant för att vidta åtgärder för att minska riskerna, särskilt i humanitära scenarier och i områden där vattenburna virusutbrott ofta förekommer.
För närvarande finns flera kommersiella tester som möjliggör kvantifiering av fekal indikatorbakterier (FIB) tillgängliga för testning vid användningstillfället. Sådana kommersiella tester är dock inte tillgängliga för detektion av virus. Upptäckten av virus i miljö vatten prover kräver att koncentrera flera liter i mindre volymer. Dessutom, när koncentrerad, upptäckten av virus förlitar sig på metoder såsom nukleinsyra utvinning och molekylär detektion (t. ex., polymeras kedjereaktion [PCR]-baserade analyser) av virala Genomes.
Den metod som beskrivs här tillåter koncentrationen av virus från 10 L vattenprover, samt utvinning av virala nukleinsyror vid tidpunkten för användning, med enkel och portabel utrustning. Detta gör det möjligt att testa vattenprover vid användnings punkten för flera virus och är användbar i humanitära scenarier, samt i alla sammanhang där ett utrustat laboratorium inte finns tillgängligt. Alternativt tillåter metoden att koncentrera virus som finns i vattenprover och frakten av koncentratet till ett laboratorium vid rumstemperatur för vidare analys.
Introduction
Under de första faserna av humanitära nödsituationer är tillgången till rent vatten, sanitet och hygien avgörande för de drabbade. Därför är övervakning av vattenkvaliteten en prioriterad fråga för att förhindra vattenburna utbrott. Det är välkänt att förorenat vatten ofta är ursprunget till sjukdomar, men det är ofta svårt att bestämma källorna till virusutbrott såsom hepatit E-virus (HEV), även med tillgången till konventionella laboratoriemetoder. Kontrollen av vattenkvaliteten baseras på kvantifieringen av FIB1,2,3,4. Det har dock dokumenterats utförligt att det inte finns något samband mellan avsaknaden av FIB och förekomsten av virala vattenburna patogener som rotavirus (RoV), norovirus (NoV) eller HEV5,6. Att använda de kriterier för vattenkvalitet som grundar sig på FIB kan således leda till en underskattning av de risker som är förknippade med förekomst av vattenburna virala patogener. Övervakningen av indikator virus, såsom humana adenovirus (hadv), eller specifika patogener skulle vara till hjälp vid fastställandet av exponeringen för virala patogener och identifiera den potentiella källan till infektion7,8, 9,10 och validering av effektiviteten av sanitära åtgärder11.
Fram till nu förlitade sig upptäckten av virus i dessa scenarier på kompetent personal och komplex logistik. VirWaTest (virwatest.org) syftar till att utveckla en enkel, prisvärd och bärbar metod för koncentrationen och efterföljande upptäckt av virus från vattenprover vid tidpunkten för användning.
Virus koncentrationen bygger på principen om organisk floculation av 10 L vattenprover, genom vilka virus återvinns i mindre volymer12,13. De flockar samlas in och läggs till en buffert som lyserar virusen och förhindrar att nukleinsyror från nedbrytning när de förvaras vid rumstemperatur i högst 2 veckor.
Den nukleinsyra extraktionsmetoden är baserad på användningen av magnetiska partiklar som nukleinsyror får adsorberat. De kan överföras från en tvättbuffert till en annan och slutligen in i elutionsbufferten med hjälp av en magnetisk pipett som partiklarna fäster. Virala nukleinsyra suspensioner erhålls kan transporteras till ett referenslaboratorium där upptäckten kan utföras med hjälp av molekylära metoder baserade på PCR. För varje nukleinsyrafutering testas två olika kvantiteter för att utesluta enzymatisk hämning som har sitt ursprung i provet. Alternativt kan PCR-test köras vid användnings punkten med minimal utrustnings tillgänglighet. Hela processen är konstruerad för att utföras oberoende av en strömförsörjning (figur 1).
En kvantitativ PCR-analys för att påvisa HAdV, som utsöndras av människor och återfinns i vattenprover i höga koncentrationer, har anpassats för att köras vid användnings punkten. HAdV används som humana fekala virala indikatorer. En PCR för quantificationen av MS2 Bakteriofag har också anpassats, sedan MS2 används i virwatest som processaa kontroll. Metoden kan anpassas för detektion av alla virus av intresse.
Efter utvecklingen har den VirWaTest metoden tillämpats av användarna i två olika inställningar i Republiken Centralafrika (RCA) och Ecuador, ge återkoppling om tillämpningen av protokollet i verkliga situationer.
Till vår kännedom, detta är det första förfarandet som gör att koncentrationen och detektion av virus vid tidpunkten för användning, oberoende av någon strömförsörjning, stor utrustning, och frysning/kyla förhållanden. Det rekommenderas att samla in två replikat av varje vattenprov för att få robusta resultat.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoden VirWaTest möjliggör koncentration av virus och nukleinsyreutvinning från vattenprover vid den tidpunkt då de används av icke-erfarna användare. Det är ett överkomligt, snabbt och enkelt protokoll. Koncentrationen bygger på principen om organisk flocympning med skummjölk, genom vilken lågt pH och hög konduktivitet gör skum mjölks proteiner samlade i flockar virusen adsorberas till. När flockar sediment är det lätt att samla in dem, vilket gör det möjligt att koncentrera 10 L vatten, medan tradit…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
VirWaTest var ett forskningsprojekt finansierat av HIF (humanitärt innovationsfonder) program för ELHRA (förbättra lärandet & forskning för humanitärt bistånd). Författarna erkänner de tvätt team som vänligt samarbetade i denna studie. Analysen av prover i Ecuador finansierades av Oxfam Ecuador och Dirección de Investigaciones de La Universidad de Las Americas (AMB. BRT. 17.01). S. Bofill-Mas är en Serra-Hunter Fellow vid universitetet i Barcelona.
Materials
| 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (ROX) | Solis BioDyne | 08-14-00001 | Includes Solis Biodyne's 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (qPCR Mix), 50 Reactions |
| 8-Microtube Strips with Caps | dD Biolab | 840637 | Low Profile, Thin Walls, Adapted for Quantitative and Qualitative PCR |
| Aquagenx CBT E. coli Kit | Aquagenx, LLC | ECCBT10 | 10 Tests per Kit |
| Batteries and Power Adapters for Magnetic Stirrer | GenIUL | 900011674 | Includes 12V car power adapter |
| Bucket Support | GenIUL | 900011648 | Aluminium support |
| Bucket, 10 L | Cater4You | 10LTR | Polypropilene, Tamperproof, Clear color |
| Centrifuge Tube, 50 mL | LabBox | CTSP-E50-050 | Polypropylene, Sterile, Graduated, With Skirt |
| Citric Acid 1-Hydrate, 500 g | PanReac AppliChem | 1410181211 | Pure, Pharma Grade, 1 Kilogram |
| Clear PET Bottle | LabBox | FPET-500-088 | Clear Color, PET, Cap Not Included |
| Difco Skim Milk, 500 g | Becton Dickinson | 232100 | Dehydrated |
| DNA/RNA Shield, 250 mL | Zymo Research | R1100-250 | DNA/RNA Preservation Medium, 250 mL |
| Easy9 Pipette Controller | LabBox | EAS9-001-001 | 0.3 μm filter, Pipettes from 0.1 to 100 mL, Autoclavable silicone pipette holder |
| Eppendorf Tube, 0.5 mL | Eppendorf | 0030121023 | Polypropilene, Safe-Lock |
| Eppendorf Tube, 2 mL | Eppendorf | 0030120094 | Polypropilene, Safe-Lock |
| Eppendorf Tube, 5 mL | dD Biolab | 999542 | Polypropylene, Sterile, Graduated |
| Ethanol 96% V/V, 1 L | Panreac AppliChem | 361085-1611 | For UV, IR and HPLC |
| Laboratory Tweezers | LabBox | FORS-007-002 | Thin, Curved End, L= 120 mm |
| Magnetic Stirrer | GenIUL | 900017000 | Battery-powered |
| Marker | dD Biolab | 929203 | Black, Extra fine Tip, Water Resistant, Fast Drying, For Plastic and Glassware |
| Micro Rota-Rack for Microtubes | dD Biolab | 37782 | 4 Modules, L x W x H= 208 x 100 x 100 mm |
| Mini8 Real-Time PCR Cycler | Coyote Biosciences, China | Mini-8 | Portable, Works with 12V Power Supplies or External Batteries, Two channels, Capacity for 8 Tubes |
| NucliSens Lysis Buffer | Biomerieux | 200292 | Reagents for up to 48 Isolations, Store at Ambient Temperature |
| Open Tip Serological Pipette, 10 mL | Deltalab | 900136N | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| PE Screw Cap PP28 | LabBox | TP28-004-020 | For PET Bottles |
| pH Indicator Strip | LabBox | WSPH-001-001 | Range pH 2.8 to pH 4.4, 50 Strips per Pack |
| Plastic Test Tube | Quimikals | 300913 | Includes Cap |
| Polyethylene Pasteur Pipette | LabBox | PIPP-003-500 | Graduated, 7 mL Overall Volume, Non-Sterile |
| Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 150 mL | Deltalab | 409726 | Screw cap, Sterile, graduated up to 100 mL |
| Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 60 mL | Deltalab | 409526G | Screw cap, Sterile, Graduated up to 50 mL |
| Powder Powder Detergent | – | – | Regular Powder Soap for washing clothes |
| Power Cables for Magnetic Stirrer | GenIUL | 900011692 | Connection between batteries and magnetic stirrers |
| QuickPick Magnetic Tool | BioNobile | 24001 | Hand-held tool for magnetic particles |
| QuickPick Tips in Box | BioNobile | 24296 | RNase-Free, Autoclaved, 96 Units |
| QuickPick XL gDNA Magnetic Particles | BioNobile | SN51100 | 3.2 mL |
| Sea Salts | Sigma-Aldrich | S9883-500G | An artificial salt mixture closely resembling the composition of the dissolved salts of ocean water |
| Silicone Tubing | LabBox | SILT-006-005 | Roll of 5 Meters, Inner ø x Outer ø= 6 x 10 mm |
| Sodium Hydroxide Pellets, 98.5 – 100.5% | VWR Chemicals | 28244295 | Pellets, 1 Kg |
| Solar Rotary Platform | SOL-EXPERT Group | 70020 | Acrylic Plate, 10 RPM, Supports up to 300 Grams |
| SOLIScript 1-step Probe Kit | Solis BioDyne | 08-57-00250 | Includes Solis Biodyne's 5x One-Step Probe Mix (qPCR Mix) and 40x One-Step SOLIScript Mix (Reverse Transcriptase Enzyme), 250 Reactions |
| SPEEDTOOLS RNA Virus Extraction Kit | BioTools | 21.141-4197 | Includes BioTools's BAW Buffer (Washing Buffer 1), BAV3 Buffer (Washing Buffer 2 and 3) and BRE Buffer (Elution Buffer). |
| SpinBar Octhaedral Stirring Magnet | dD Biolab | 045926 | Pivot Ring, L x ø = 38 x 8 mm, Blue |
| Tape-End Serological Pipette, 10 mL | Deltalab | PN10E1 | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| Tape-End Serological Pipette, 50 mL | Deltalab | 900043 | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| Termi-DNA-Tor – Nucleic Acid Remover | BioTools | 22001-4291 | Remover of nucleic acids, bacteria, fungi and mycoplasma from material and surfaces, 450 mL |
| Water Molecular Biology Reagent, 1L | Sigma-Aldrich | W4502-1L | Nuclease and Protease Free, 0.1 μm Filtered |
| Whirl-Pak Bag, 540 mL | Deltalab | 200361 | Stable bottom |
| Zip Lock Plain Bag | LabBox | BZIP-080-100 | Polyethylene, L x W= 120 x 80 mm |
References
- The Sphere Project. . The Sphere Project: Humanitarian Charter and Minimum Standards in Humanitarian Response. , (2011).
- Bartram, J., et al. . Water Safety Plan Manual:Step-by-step risk management for drinking-water suppliers. , (2009).
- World Health Organization. . Guidelines for Drinking-water Quality. , (2011).
- World Health Organization. . 25 Years Progress on Sanitation and Drinking Water. , (2015).
- Girones, R., et al. Molecular detection of pathogens in water – The pros and cons of molecular techniques. Water Research. 44 (15), 4325-4339 (2010).
- Rodriguez-Manzano, J., et al. Standard and new fecal indicators and pathogens in sewage treatment plants, microbiological parameters for improving the control of reclaimed water. Water Science and Technology. 66 (12), 2517-2523 (2012).
- Puig, M., et al. Detection of adenoviruses and enteroviruses in polluted waters by nested PCR amplification. Applied and Environmental Microbiology. 60 (8), 2963-2970 (1994).
- Carter, M. J. Enterically infecting viruses: Pathogenicity, transmission and significance for food and waterborne infection. Journal of Applied Microbiology. 98 (6), 1354-1380 (2005).
- Bofill-Mas, S., Pina, S., Girones, R. Documenting the epidemiologic patterns of polyomaviruses in human populations by studying their presence in urban sewage. Applied and Environmental Microbiology. 66 (1), 238-245 (2000).
- Bofill-Mas, S., et al. Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices. Applied and Environmental Microbiology. 72 (12), 7894-7896 (2006).
- Rames, E., Roiko, A., Stratton, H., Macdonald, J. Technical aspects of using human adenovirus as a viral water quality indicator. Water Research. 96, 308-326 (2016).
- Calgua, B., et al. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. Journal of Virological Methods. 153 (2), 79-83 (2008).
- Bofill-Mas, S., et al. Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses. Journal of Visualized Experiments. 58, 5-9 (2011).
- International Organization for Standardization. . ISO 10705-1:1995: Water quality – Detection and enumeration of bacteriophages – Part 1: Enumeration of F-specific RNA bacteriophages. , (1995).
- Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report. Applied and Environmental Microbiology. 68 (9), 4523-4533 (2002).
- Pecson, B. M., Martin, L. V., Kohn, T. Quantitative PCR for determining the infectivity of bacteriophage MS2 upon inactivation by heat, UV-B radiation, and singlet oxygen: Advantages and limitations of an enzymatic treatment to reduce false-positive results. Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5544-5554 (2009).
- Calgua, B., Barardi, C. R. M., Bofill-Mas, S., Rodriguez-Manzano, J., Girones, R. Detection and quantitation of infectious human adenoviruses and JC polyomaviruses in water by immunofluorescence assay. Journal of Virological Methods. 171 (1), 1-7 (2011).
- Bofill-Mas, S., et al. Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses. Journal of Visualized Experiments. (58), e2820 (2011).
- Gonzales-Gustavson, E., et al. Characterization of the efficiency and uncertainty of skimmed milk flocculation for the simultaneous concentration and quantification of water-borne viruses, bacteria and protozoa. Journal of Microbiological Methods. 134, 46-53 (2017).
