VirWaTest, su örnekleri virüslerin tespiti için bir nokta-of-kullanım yöntemi
Summary
Burada VirWaTest sunuyoruz, hangi kullanım noktasında su örneklerinden virüslerin konsantrasyonu ve tespiti için basit, uygun fiyatlı ve taşınabilir bir yöntemdir.
Abstract
İnsanlar ve hayvanlar tarafından atılan virüsler su kaynaklarını kirletebilir ve bu su içme, gıda sulama, yıkama, vb. için kullanıldığında insan sağlığına risk teşkil edebilir. Klasik dışkı bakteri göstergesi her zaman viral patojenlerin varlığını kontrol etmez, böylece viral patojenlerin ve viral göstergelerin tespiti, özellikle insani senaryolar ve bölgelerde risk azaltma önlemlerinin benimsenmesi için geçerlidir. su kaynaklı viral salgınlar sık görülür.
Şu anda, dışkı göstergesi bakterilerinin (FıB) ölçülmesine izin veren çeşitli ticari testler, kullanım noktasında test etmek için kullanılabilir. Ancak, bu tür ticari testler virüslerin algılanması için kullanılabilir değildir. Çevresel su örneklerindeki virüslerin algılanması, birkaç litreye daha küçük hacimlere yoğunlaşmasını gerektirir. Dahası, bir kez konsantre, virüslerin tespiti nüklenik asit ekstraksiyon ve moleküler algılama (örn., viral genomların polimeraz zincir reaksiyonu [PCR]-based) gibi yöntemlerle dayanır.
Burada açıklanan yöntem, 10 L su numuneleri virüslerin konsantrasyonu yanı sıra, basit ve taşınabilir ekipman ile kullanım noktasında viral nüklerik asitlerin çıkarılması sağlar. Bu, çeşitli virüsler için kullanım noktasında su örneklerinin test edilmesini sağlar ve insani senaryolardaki yanı sıra, donanımlı bir laboratuvarda mevcut olmayan herhangi bir bağlamda yararlıdır. Alternatif olarak, yöntem, su numuneleri ve daha fazla analiz için oda sıcaklığında bir laboratuvarda konsantre nakliye mevcut virüs konsantre sağlar.
Introduction
Herhangi bir insani acil durum ilk aşamalarında, temiz su temini, sanitasyon ve hijyen erişim etkilenen bu hayatta kalmak için önemlidir. Bu nedenle, su kalitesini izlemek suyun kaynaklı salgınları önlemek için bir önceliktir. Bu kontamine su sıklıkla hastalıkların kökeni bilinmektedir, ama genellikle Hepatit E virüsü gibi viral salgınlar kaynaklarını belirlemek zordur (HEV), konvansiyonel laboratuvar yöntemlerinin kullanılabilirliği bile. Su kalitesinin kontrolü fib1,2,3,4‘ ün ölçülmesini temel alır. Ancak, fib yokluğunda ve Rotavirüs (RoV), norovirüs (Nov) veya HEV5,6gibi viral su kaynaklı patojenlerin varlığı arasında hiçbir korelasyon olmadığı konusunda kapsamlı olarak belgelenmiştir. Böylece, FıB ‘ye dayanan su kalitesi kriterlerinin kullanılması, su kaynaklı viral patojenlerin varlığı ile ilgili risklerin hafife almasına neden olabilir. İnsan adenovirüsler (hadv) veya spesifik patojenler gibi gösterge virüslerinin gözetimi, viral patojenlere maruz kalmanın tanımlanması ve insan enfeksiyonunun potansiyel kaynağını tanımlamak için yararlı olacaktır7,8, 9,10 ve sanitasyon tedbirlerinin etkinliğini doğrulamak için11.
Bugüne kadar, bu senaryolarda virüslerin tespiti yetenekli personel ve karmaşık lojistik üzerinde dayanılır. VirWaTest (virwatest.org), kullanım noktasında su örneklerinden gelen virüslerin konsantrasyonu ve daha sonra tespiti için basit, uygun maliyetli ve taşınabilir bir yöntemin geliştirilmesine yöneliktir.
Virüs konsantrasyonu, 10 L su numunelerinin organik flocculasyonu ilkesine dayanmaktadır ve bu da virüsler daha küçük hacimlerde12,13‘ te kurtarılır. Flokların ya toplanır ve virüsler yapışıklıkların bir tampon eklenir ve onlar daha fazla değil, oda sıcaklığında saklanan nüklik asitler bozulması önler 2 hafta.
Nükle asit ekstraksiyon yöntemi, nüklik asitlerin adsoryat ettiği manyetik partiküllerin kullanımına dayanır. Onlar bir yıkama tampondan diğerine transfer edilebilir ve sonunda parçacıklar iliştirmek için bir manyetik pipet kullanarak elüsyon tampon içine. Viral nüklik asit süspansiyonları, PCR bazlı moleküler yöntemler kullanılarak tespit edilebilecek bir referans laboratuvarına sevk edilebilir. Her nükleik asit ekstraksiyon için, iki farklı miktarlarda numunenin kökeni enzimatik inhibisyonu dışarı kural test edilir. Alternatif olarak, minimum ekipman kullanılabilirliği ile, PCR testleri kullanım noktasında çalıştırılabilir. Tüm işlem bir güç kaynağından bağımsız olarak gerçekleştirilecek şekilde tasarlanmıştır (Şekil 1).
İnsan tarafından atılan ve yüksek konsantrasyonlarda Atıksu örneklerinde bulunan HAdV algılamak için nicel bir PCR tahlil, kullanım noktasında çalışacak şekilde adapte edilmiştir. HAdV insan dışkı viral göstergeler olarak kullanılır. MS2 bakteriyofaj için bir PCR de MS2 bu yana proses kontrolü olarak VirWaTest kullanılır adapte edilmiştir. Yöntem ilgi herhangi bir virüs tespiti için özelleştirilmiş olabilir.
Kalkınma sonrası, VirWaTest yöntemi, gerçek durumlarda protokolün uygulanması hakkında geribildirim sağlayan Orta Afrika Cumhuriyeti (RCA) ve Ekvador iki farklı ayarlarında kullanıcılar tarafından uygulandı.
Bizim bilginiz için, bu kullanım noktasında virüslerin konsantrasyonu ve algılanmasını sağlayan ilk işlemdir, herhangi bir güç kaynağı bağımsız, büyük ekipman, ve donma/soğutma koşulları. Sağlam sonuçlar elde etmek için her bir su örneğinin iki çoğaltır toplamak için tavsiye edilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
VirWaTest yöntemi, deneyimli olmayan kullanıcılar tarafından kullanım noktasında virüs ve nüklik asit ekstraksiyonu su örneklerinden konsantrasyonu sağlar. Bu, uygun maliyetli, hızlı ve basit bir protokoldür. Konsantrasyon, düşük pH ve yüksek iletkenlik koşullarında yağsız süt proteinlerinin, virüslerin adsorbe olduğu flokların ya içine toplu hale getiren, yağsız süt kullanılarak organik flocculasyon ilkesine dayanır. Ne zaman flokların ya sediment, onları toplamak kolay, 10 L su konsantr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
VirWaTest bir araştırma projesi HıF tarafından finanse edildi (Insani yenilik fonları) ELHRA programı (geliştirme öğrenme & Insani yardım için araştırma). Yazarlar bu çalışmada nazikçe işbirliği yapan WASH ekipleri kabul eder. Ekvador numunelerin Analizi Oxfam Ecuador ve Dirección de araştırma de la Universidad de Las Americas tarafından finanse edildi (AMB. BRT. 17.01). S. Bofill-Mas Barcelona Üniversitesi ‘nde bir Serra-Hunter adam.
Materials
| 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (ROX) | Solis BioDyne | 08-14-00001 | Includes Solis Biodyne's 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (qPCR Mix), 50 Reactions |
| 8-Microtube Strips with Caps | dD Biolab | 840637 | Low Profile, Thin Walls, Adapted for Quantitative and Qualitative PCR |
| Aquagenx CBT E. coli Kit | Aquagenx, LLC | ECCBT10 | 10 Tests per Kit |
| Batteries and Power Adapters for Magnetic Stirrer | GenIUL | 900011674 | Includes 12V car power adapter |
| Bucket Support | GenIUL | 900011648 | Aluminium support |
| Bucket, 10 L | Cater4You | 10LTR | Polypropilene, Tamperproof, Clear color |
| Centrifuge Tube, 50 mL | LabBox | CTSP-E50-050 | Polypropylene, Sterile, Graduated, With Skirt |
| Citric Acid 1-Hydrate, 500 g | PanReac AppliChem | 1410181211 | Pure, Pharma Grade, 1 Kilogram |
| Clear PET Bottle | LabBox | FPET-500-088 | Clear Color, PET, Cap Not Included |
| Difco Skim Milk, 500 g | Becton Dickinson | 232100 | Dehydrated |
| DNA/RNA Shield, 250 mL | Zymo Research | R1100-250 | DNA/RNA Preservation Medium, 250 mL |
| Easy9 Pipette Controller | LabBox | EAS9-001-001 | 0.3 μm filter, Pipettes from 0.1 to 100 mL, Autoclavable silicone pipette holder |
| Eppendorf Tube, 0.5 mL | Eppendorf | 0030121023 | Polypropilene, Safe-Lock |
| Eppendorf Tube, 2 mL | Eppendorf | 0030120094 | Polypropilene, Safe-Lock |
| Eppendorf Tube, 5 mL | dD Biolab | 999542 | Polypropylene, Sterile, Graduated |
| Ethanol 96% V/V, 1 L | Panreac AppliChem | 361085-1611 | For UV, IR and HPLC |
| Laboratory Tweezers | LabBox | FORS-007-002 | Thin, Curved End, L= 120 mm |
| Magnetic Stirrer | GenIUL | 900017000 | Battery-powered |
| Marker | dD Biolab | 929203 | Black, Extra fine Tip, Water Resistant, Fast Drying, For Plastic and Glassware |
| Micro Rota-Rack for Microtubes | dD Biolab | 37782 | 4 Modules, L x W x H= 208 x 100 x 100 mm |
| Mini8 Real-Time PCR Cycler | Coyote Biosciences, China | Mini-8 | Portable, Works with 12V Power Supplies or External Batteries, Two channels, Capacity for 8 Tubes |
| NucliSens Lysis Buffer | Biomerieux | 200292 | Reagents for up to 48 Isolations, Store at Ambient Temperature |
| Open Tip Serological Pipette, 10 mL | Deltalab | 900136N | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| PE Screw Cap PP28 | LabBox | TP28-004-020 | For PET Bottles |
| pH Indicator Strip | LabBox | WSPH-001-001 | Range pH 2.8 to pH 4.4, 50 Strips per Pack |
| Plastic Test Tube | Quimikals | 300913 | Includes Cap |
| Polyethylene Pasteur Pipette | LabBox | PIPP-003-500 | Graduated, 7 mL Overall Volume, Non-Sterile |
| Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 150 mL | Deltalab | 409726 | Screw cap, Sterile, graduated up to 100 mL |
| Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 60 mL | Deltalab | 409526G | Screw cap, Sterile, Graduated up to 50 mL |
| Powder Powder Detergent | – | – | Regular Powder Soap for washing clothes |
| Power Cables for Magnetic Stirrer | GenIUL | 900011692 | Connection between batteries and magnetic stirrers |
| QuickPick Magnetic Tool | BioNobile | 24001 | Hand-held tool for magnetic particles |
| QuickPick Tips in Box | BioNobile | 24296 | RNase-Free, Autoclaved, 96 Units |
| QuickPick XL gDNA Magnetic Particles | BioNobile | SN51100 | 3.2 mL |
| Sea Salts | Sigma-Aldrich | S9883-500G | An artificial salt mixture closely resembling the composition of the dissolved salts of ocean water |
| Silicone Tubing | LabBox | SILT-006-005 | Roll of 5 Meters, Inner ø x Outer ø= 6 x 10 mm |
| Sodium Hydroxide Pellets, 98.5 – 100.5% | VWR Chemicals | 28244295 | Pellets, 1 Kg |
| Solar Rotary Platform | SOL-EXPERT Group | 70020 | Acrylic Plate, 10 RPM, Supports up to 300 Grams |
| SOLIScript 1-step Probe Kit | Solis BioDyne | 08-57-00250 | Includes Solis Biodyne's 5x One-Step Probe Mix (qPCR Mix) and 40x One-Step SOLIScript Mix (Reverse Transcriptase Enzyme), 250 Reactions |
| SPEEDTOOLS RNA Virus Extraction Kit | BioTools | 21.141-4197 | Includes BioTools's BAW Buffer (Washing Buffer 1), BAV3 Buffer (Washing Buffer 2 and 3) and BRE Buffer (Elution Buffer). |
| SpinBar Octhaedral Stirring Magnet | dD Biolab | 045926 | Pivot Ring, L x ø = 38 x 8 mm, Blue |
| Tape-End Serological Pipette, 10 mL | Deltalab | PN10E1 | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| Tape-End Serological Pipette, 50 mL | Deltalab | 900043 | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| Termi-DNA-Tor – Nucleic Acid Remover | BioTools | 22001-4291 | Remover of nucleic acids, bacteria, fungi and mycoplasma from material and surfaces, 450 mL |
| Water Molecular Biology Reagent, 1L | Sigma-Aldrich | W4502-1L | Nuclease and Protease Free, 0.1 μm Filtered |
| Whirl-Pak Bag, 540 mL | Deltalab | 200361 | Stable bottom |
| Zip Lock Plain Bag | LabBox | BZIP-080-100 | Polyethylene, L x W= 120 x 80 mm |
References
- The Sphere Project. . The Sphere Project: Humanitarian Charter and Minimum Standards in Humanitarian Response. , (2011).
- Bartram, J., et al. . Water Safety Plan Manual:Step-by-step risk management for drinking-water suppliers. , (2009).
- World Health Organization. . Guidelines for Drinking-water Quality. , (2011).
- World Health Organization. . 25 Years Progress on Sanitation and Drinking Water. , (2015).
- Girones, R., et al. Molecular detection of pathogens in water – The pros and cons of molecular techniques. Water Research. 44 (15), 4325-4339 (2010).
- Rodriguez-Manzano, J., et al. Standard and new fecal indicators and pathogens in sewage treatment plants, microbiological parameters for improving the control of reclaimed water. Water Science and Technology. 66 (12), 2517-2523 (2012).
- Puig, M., et al. Detection of adenoviruses and enteroviruses in polluted waters by nested PCR amplification. Applied and Environmental Microbiology. 60 (8), 2963-2970 (1994).
- Carter, M. J. Enterically infecting viruses: Pathogenicity, transmission and significance for food and waterborne infection. Journal of Applied Microbiology. 98 (6), 1354-1380 (2005).
- Bofill-Mas, S., Pina, S., Girones, R. Documenting the epidemiologic patterns of polyomaviruses in human populations by studying their presence in urban sewage. Applied and Environmental Microbiology. 66 (1), 238-245 (2000).
- Bofill-Mas, S., et al. Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices. Applied and Environmental Microbiology. 72 (12), 7894-7896 (2006).
- Rames, E., Roiko, A., Stratton, H., Macdonald, J. Technical aspects of using human adenovirus as a viral water quality indicator. Water Research. 96, 308-326 (2016).
- Calgua, B., et al. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. Journal of Virological Methods. 153 (2), 79-83 (2008).
- Bofill-Mas, S., et al. Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses. Journal of Visualized Experiments. 58, 5-9 (2011).
- International Organization for Standardization. . ISO 10705-1:1995: Water quality – Detection and enumeration of bacteriophages – Part 1: Enumeration of F-specific RNA bacteriophages. , (1995).
- Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report. Applied and Environmental Microbiology. 68 (9), 4523-4533 (2002).
- Pecson, B. M., Martin, L. V., Kohn, T. Quantitative PCR for determining the infectivity of bacteriophage MS2 upon inactivation by heat, UV-B radiation, and singlet oxygen: Advantages and limitations of an enzymatic treatment to reduce false-positive results. Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5544-5554 (2009).
- Calgua, B., Barardi, C. R. M., Bofill-Mas, S., Rodriguez-Manzano, J., Girones, R. Detection and quantitation of infectious human adenoviruses and JC polyomaviruses in water by immunofluorescence assay. Journal of Virological Methods. 171 (1), 1-7 (2011).
- Bofill-Mas, S., et al. Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses. Journal of Visualized Experiments. (58), e2820 (2011).
- Gonzales-Gustavson, E., et al. Characterization of the efficiency and uncertainty of skimmed milk flocculation for the simultaneous concentration and quantification of water-borne viruses, bacteria and protozoa. Journal of Microbiological Methods. 134, 46-53 (2017).
