소 무릎 이식에서 연골 리모델링의 전 생체 외 조직 문화 모델
Summary
여기에서, 우리는 소 무릎에서 연골 이식의 격리 및 배양을 설명하는 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 관절을 표적으로 하는 생물학적 자극 또는 새로운 치료법에 반응하여 조직 변화를 설명하기 위한 쉽고 접근가능한 도구를 제공한다.
Abstract
Ex vivo 배양 시스템은 네이티브 환경에서 조직 및 세포 기능을 연구하는 데 전념하는 광범위한 실험을 다룹니다. 연골은 활액 관절의 적절한 기능에 중요한 독특한 조직이며, 프로테오글리칸과 타입 II 콜라겐이 풍부한 조밀한 세포외 매트릭스(ECM)로 구성됩니다. 연골 세포는 연골 내에 존재하는 유일한 세포 유형이며 광범위하고 상대적으로 숫자가 낮습니다. 변경된 외부 자극 및 세포 신호는 골관절염 (OA) 및 류마치스성 관절염과 같은 질병에 있는 중요한 병리학 적인 특징인 ECM 조성 그리고 열화에 있는 변경으로 이끌어 낼 수 있습니다.
Ex vivo 연골 모델은 1) 연골 조직 회전율의 연골 세포 매개 변경의 프로파일링을 허용하고, 2) 연골 ECM 조성물을 시각화하고, 3) 연골 세포 재배열을 조직에서 직접 재배열할 수 있다. 자극 또는 치료에 대한 응답으로 이러한 변경을 프로파일링은 연골 생물학의 다양한 측면에서 매우 중요하며, 분리 된 연골 세포에서 시험관 내 실험, 또는 실험 조건이있는 살아있는 동물의 복잡한 모델을 보완합니다. 제어하기가 더 어렵습니다.
연골 전지는 제어 가능한 설정에서 연골 ECM에서 조직 리모델링을 평가하기위한 번역 및 쉽게 접근 할 수있는 방법을 제시한다. 여기에서, 우리는 살아있는 소 연골 이식을 격리하고 배양하기위한 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 소 무릎의 조직을 사용하며, 현지 도축장에서 쉽게 접근 할 수 있습니다. 이식 및 컨디셔닝 된 배양 배지 모두 조직 회전율, ECM 조성 및 연골 세포 기능을 조사하기 위해 분석 될 수 있으며, 따라서 ECM 변조를 프로파일링합니다.
Introduction
연골 세포는 연골 매트릭스를 생성하고 유지합니다. 연골 세포의 생물학을 연구하고 그들과 주변 ECM이 외부 자극에 어떻게 반응하는지 연구하기 위해서는 그들의 모국 환경에서 심문하는 것이 중요합니다1,2. 연골 조직 회전율을 공부하는 것은 OA와 같은 합동 질병에 있는 근본적인 기계장치의 이해를 증가시키기 위하여 중요합니다, 질병 은 현재 아무 질병 변경 처리도 없습니다. 따라서 더 나은 번역 모델2에대한 상당한 필요성이 있습니다.
세포 및 조직 효과의 생체 내 특성화는 연골세포 단층 배양과 같은 체외 및 생체 내, 수술 유발 OA 모델 또는 자가면역 콜라겐 유도 관절염 모델(CIA)을 보완하는 데 필수적입니다. ). 수많은 연구는 세포가 2D 단층 배양과 3D 구조또는 그들의 기본 조직에서 어떻게 행동하는지의 차이를 강조했다3,4. 2D 층의 많은 세포는 세포 극성과 조직 부착의 차이를 포함하여 부자연스러운 형태를 채택하여 기본 조직 내의 세포에서 시각적 및 기능적 차이를 모두초래합니다 5. 그 차이는 또한 단백질 발현을 변화시킬 수 있는 세포의 기능성에서 명백하며, 이는 심오한 변화된 분화 패턴, 조절 기계 및 세포 기능5,6,7로 이어진다. ,8.
연골 ECM은 주로 매트릭스 프레임 워크를 제공하는 유형 II 콜라겐으로 구성, 그리고 aggrecan, 조직 내에서 유체를 유지하는 데 도움이 프로테오글리칸. 콜라겐 형 IV, VI, IX, X, XII, 피브로넥틴, 연골 올리고메릭 단백질(COMP), 빅리칸, 데코린 및 펄칸과 같은 다른 매트릭스 분자도9.
OA의 병인학은 불분명하게 남아 있는 동안10,11,질병의 개시는 조직 회전율 및 수리 과정의 불균형에 기인하는 것으로 여겨진다12,13. 관절 연골의 저하는 OA의 특징입니다. 주변 조직에 있는 연골 세포 또는 세포는 사이토카인의 그들의 방출을 증가시키고, 매트릭스 금속 단백질성 (MMPs) 및 동맥과 같은 단백질아종의 높은 생산을 자극하여 연골 ECM의 분해를 증가시다. 14.이러한 분해는 신에피토프라고 불리는 작은 독특한 단백질 단편의 방출을 초래하며, 이는 혈청, 소변, 또는 배양 배지15에서정량화될 수 있다. 콜라겐의 형성과 성숙시, 소위 profragments는 또한 풀어 놓입니다; 이들은 매트릭스 생산(16)의측정으로 정량화 될 수있다.
이 프로토콜의 목적은 ECM 조직 회전율에 대한 자극 및 / 또는 약물 치료의 효과를 비교하기 위해 생체 연골 모델을 확립하는 것입니다. 연골 회전율은 ELISA를 사용하여 컨디셔닝 된 배양 배지에서 매트릭스 유래 네오 에피토프 바이오 마커를 직접 측정하여 프로파일링됩니다: AGNx1 (응형 활성 반영), C2M (반사 매트릭스 MMP 활성), 및 ProC2 (반성 형 II 콜라겐 반사) 형성)을 형성합니다. 사실 인정은 또한 개별 적인 이식에 있는 연골 세포의 조직을 구상하는 ECM의 조직학 염색에 의해 확인될 수 있습니다. 기재된 프로토콜은 연골세포 기능 및 연골 ECM 회전율에 대한 신규한 치료법의 효과를 테스트하는데 사용될 수 있다. 많은 연구에서 생물학적 과정 또는 정량적 조직학적 또는 면역 조직화학적 접근법, mRNA, 단백질 발현 또는 프로테오믹스를 사용하여 사이토카인 도전 이식에 대한 개입의 효과를 설명하기 위해 연골 이식을 사용했습니다2 ,17,18. 그러나 이러한 프로토콜은 현재 원고의 범위를 벗어납니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
소 연골 이식에서 연골 조직 회전율의 프로파일링을 위해 여기에 제시 된 프로토콜은 염증성 세포 내 경로의 억제제, 억제제를 포함하여 많은 유형의 약물의 치료 효과를 특성화하는 데 사용할 수 있습니다. 프로테올리산 효소, 또는 단백 동화 성장 인자.
두 개의 다른 설정이 프로토콜에 설명 되었다: 이식 인슐린 같은 성장 인자로 자극 했다 단백 동화 설정 1 (IGF-1), 그리고 TN…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 실험실 지원을 위한 북유럽 생명과학의 기술 직원, 그리고 우리의 연구의 일반적인 지원을 위한 덴마크 연구 재단에 감사드립니다.
Materials
| 45% Iron(III) chloride solution | Sigma-Aldrich | 12322 | |
| Acetic acid | Merck | 1.00056.2500 | |
| Alamar Blue | Life tech Invitrogen | DAL1100 | |
| Biopsy processing cassettes – green | IHCWORLD | BC-0109G | |
| Biopsy punch W/Plunger (3 mm) | Scandidat | MTP-33-32 | |
| Bovine cartilage (Bovine knees) | Local slaughterhouse | ||
| C2M | Nordic Bioscience | Fee for service | |
| Corning 96-well plate | Sigma-Aldrich | CLS7007 | |
| Cover Glass Ø 13 mm | VWR | 631-0150P | |
| DMEM/F12-GlutaMAX Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) without HEPES | Gibco | 31331-028 | |
| Ethanol ≥96% | VWR | 83804.36 | |
| Ethanol absolute ≥99.5% | VWR | 83813.36 | |
| exAGNx1 | Nordic Bioscience | Fee for service | |
| exPRO-C2 | Nordic Bioscience | Fee for service | |
| Fast green | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Formaldehyde solution 4% | Merck | 1004965000 | |
| GM6001 | Sigma-Aldrich | M5939-5MG | |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H3136 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 30721-M | |
| IGF-1 | Sigma-Aldrich | I3769-50UG | |
| Oncostatin M | Sigma-Aldrich | O9635-10UG | |
| Penicillin-streptomycin (P/S) | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Pertex (mounting medium for light microscopy) | HistoLab | 811 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Safranin O | Sigma-Aldrich | S2255 | |
| Sterile Standard Scalpels | Integra Miltex | 12-460-451 | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 30743 | |
| SUPERFROST PLUS Adhesion Microscope Slides | Thermo scientific | J1800AMNT | |
| TNF-alpha | R&D Systems | 210-TA-100 | |
| Toluene | Merck | 1.08327.2500 | |
| Vacuum Filtration "rapid"-Filtermax | TPP | 99955 |
References
- Cope, P. J., Ourradi, K., Li, Y., Sharif, M. Models of osteoarthritis: the good, the bad and the promising. Osteoarthritis and Cartilage. 27 (2), 230-239 (2018).
- Thysen, S., Luyten, F. P., Lories, R. J. U. Targets, models and challenges in osteoarthritis research. Disease Models & Mechanisms. 8 (1), 17-30 (2015).
- Reker, D., et al. Articular cartilage from osteoarthritis patients shows extracellular matrix remodeling over the course of treatment with sprifermin (recombinant human fibroblast growth factor 18). Osteoarthritis and Cartilage. 26, S43 (2018).
- Kjelgaard-Petersen, C., et al. Synovitis biomarkers: ex vivo characterization of three biomarkers for identification of inflammatory osteoarthritis. Biomarkers. 20 (8), 547-556 (2015).
- Henriksen, K., et al. A specific subtype of osteoclasts secretes factors inducing nodule formation by osteoblasts. Bone. 51 (3), 353-361 (2012).
- Gigout, A., et al. Sprifermin (rhFGF18) enables proliferation of chondrocytes producing a hyaline cartilage matrix. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (11), 1858-1867 (2017).
- Reker, D., et al. Sprifermin (rhFGF18) modulates extracellular matrix turnover in cartilage explants ex vivo. Journal of Translational Medicine. 15 (1), 3560 (2017).
- Karsdal, M. A. Introduction. Biochemistry of Collagens, Laminins and Elastin. , (2016).
- Heinegård, D., Saxne, T. The role of the cartilage matrix in osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 50-56 (2011).
- Karsdal, M. A., et al. Osteoarthritis– a case for personalized health care?. Osteoarthritis and Cartilage. 22 (1), 7-16 (2014).
- Karsdal, M. A., Bay-Jensen, A. C., Henriksen, K., Christiansen, C. The pathogenesis of osteoarthritis involves bone, cartilage and synovial inflammation: may estrogen be a magic bullet?. Menopause International. 18 (4), 139-146 (2012).
- Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis and Rheumatism. 64 (6), 1697-1707 (2012).
- Goldring, M. B., Goldring, S. R. Osteoarthritis. Journal of Cellular Physiology. 213 (3), 626-634 (2007).
- Karsdal, M. A., et al. The coupling of bone and cartilage turnover in osteoarthritis: opportunities for bone antiresorptives and anabolics as potential treatments?. Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (2), 336-348 (2014).
- Genovese, F., Karsdal, M. A. Protein degradation fragments as diagnostic and prognostic biomarkers of connective tissue diseases: understanding the extracellular matrix message and implication for current and future serological biomarkers. Expert Review of Proteomics. 13 (2), 213-225 (2016).
- Gudmann, N. S., et al. Cartilage turnover reflected by metabolic processing of type II collagen: a novel marker of anabolic function in chondrocytes. International Journal of Molecular Sciences. 15 (10), 18789-18803 (2014).
- Madej, W., van Caam, A., Davidson, E. B., Buma, P., van der Kraan, P. M. Unloading results in rapid loss of TGFβ signaling in articular cartilage: role of loading-induced TGFβ signaling in maintenance of articular chondrocyte phenotype?. Osteoarthritis and Cartilage. 24 (10), 1807-1815 (2016).
- Kjelgaard-Petersen, C. F., et al. Translational biomarkers and ex vivo models of joint tissues as a tool for drug development in rheumatoid arthritis. Arthritis & Rheumatology. 70 (9), 1419-1428 (2018).
- Wang, B., et al. Suppression of MMP activity in bovine cartilage explants cultures has little if any effect on the release of aggrecanase-derived aggrecan fragments. BMC Research Notes. 2 (4), 259 (2009).
- Bay-Jensen, A. C., et al. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISAs) for metalloproteinase derived type II collagen neoepitope, CIIM—Increased serum CIIM in subjects with severe radiographic osteoarthritis. Clinical Biochemistry. 44 (5-6), 423-429 (2011).
- Lories, R. J., Luyten, F. P. The bone-cartilage unit in osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 43-49 (2011).
