Her presenterer vi en protokoll som beskriver isolering og dyrking av brusk explants fra storfe knær. Denne metoden gir et enkelt og tilgjengelig verktøy for å beskrive vevs endringer som følge av biologiske stimuli eller nye legemiddel selskap som er målrettet mot leddet.
Ex vivo kultur systemer dekker et bredt spekter av eksperimenter dedikert til å studere vev og cellulær funksjon i en innfødt setting. Brusk er et unikt vev viktig for riktig funksjon av synovial felles og er konstituert av en tett ekstracellulære matrise (ECM), rik på proteoglycan og type II kollagen. Chondrocytes er den eneste celletypen som finnes i brusk og er utbredt og relativt lav i antall. Endrede eksterne stimuli og cellulær signal kan føre til endringer i ECM sammensetning og forringelse, som er viktige patologiske kjennetegn i sykdommer som artrose (OA) og revmatoid artritt.
Ex vivo brusk modeller tillate 1) profilering av chondrocyte mediert endringer av brusk vev omsetning, 2) visualisere brusk ECM sammensetning, og 3) chondrocyte omorganisering direkte i vevet. Profilering av disse endringene som svar på stimuli eller behandlinger er av stor betydning i ulike aspekter av brusk biologi, og utfylle in vitro eksperimenter i isolerte chondrocytes, eller mer komplekse modeller i levende dyr der eksperimentelle forhold er vanskeligere å kontrollere.
Brusk explants presentere en translational og lett tilgjengelig metode for å vurdere vev remodeling i brusk ECM i kontrollerbar innstillinger. Her beskriver vi en protokoll for å isolere og dyrking lever storfe brusk explants. Metoden bruker vev fra storfe kneet, som er lett tilgjengelig fra den lokale slakteri. Både explants og conditioned kultur medium kan analyseres for å undersøke vev omsetning, ECM sammensetning, og chondrocyte funksjon, og dermed profilering ECM moduleringshjul.
Chondrocytes produsere og vedlikeholde brusk matrise. For å studere biologi av chondrocytes og hvordan de og de omkringliggende ECM reagerer på eksterne stimuli, er det avgjørende å forhøre dem i sitt eget miljø1,2. Studere brusk omsetning er viktig å øke forståelsen av de underliggende mekanismene i leddsykdommer som OA, en sykdom som det er for tiden ingen sykdom modifisere behandling. Følgelig er det et betydelig behov for bedre oversettelse modeller2.
Ex vivo karakterisering av celle-og vevs effekter er viktig å utfylle andre prekliniske modeller, både in vitro, slik som chondrocyte monolag kulturer, og in vivo, som kirurgi-indusert OA modeller eller autoimmune kollagen-indusert artritt modell (CIA ). Tallrike studier har fremhevet forskjellene mellom hvordan cellene oppfører seg i 2D-monolag kulturer og 3D-strukturer eller i sitt eget vev3,4. Mange celler i 2D lag vedta unaturlig morfologier, inkludert forskjeller i celle polaritet og vev vedlegg, noe som resulterer i både visuelle og funksjonelle forskjeller i celler innen native vev5. Forskjellene er også tydelig i funksjonaliteten til cellene, som kan skifte protein uttrykk, som fører til dypt endrede differensiering mønstre, regulatoriske maskiner, og celle funksjonalitet5,6,7 ,8.
Brusk ECM består hovedsakelig av type II kollagen som gir en matrise rammeverk, og aggrecan, en proteoglycan som bidrar til å beholde væske i vevet. Andre Matrix molekyler som kollagen type IV, VI, IX, X, XI, XII, fibronektin, brusk oligomer protein (COMP), biglycan, decorin, og perlecan er også til stede9.
Mens etiologi av OA er fortsatt uklart10,11, er utbruddet av sykdommen antas å være forårsaket av ubalanser i vev omsetning og reparasjonsprosesser12,13. Nedbrytning av ledd brusk er et kjennetegn på OA. Brusk-Resident chondrocytes eller celler i omkringliggende vev øke sin frigjøring av cytokiner, stimulere forhøyet produksjon av proteinaser som matrise metalloproteinases (MMPs) og aggrecanases, som øker nedbrytning av brusk ECM 14. denne degradering resulterer i utgivelsen av små unike protein fragmenter kalt neo-epitopes, som kan kvantifisert i serum, urin, eller kultur medium15. Ved dannelse og modning av kollagen, såkalte profragments er også utgitt; Disse kan være kvantifisert som et mål på matrise produksjon16.
Målet med denne protokollen er å etablere en ex vivo brusk modell for å sammenligne effekten av stimulering og/eller narkotikabehandling på ECM vev omsetning. Brusk omsetning er profilert ved å måle matrise-avledet neo-epitope biomarkører direkte i betinget kultur medium bruker ELISA: AGNx1 (reflekterende aggrecanase aktivitet), C2M (reflekterende matrise MMP aktivitet), og ProC2 (reflekterende type II kollagen og formasjon). Funnene kan verifiseres ved histologiske farging av ECM, som også visualiserer organiseringen av chondrocytes i den enkelte explants. Den beskrevne protokollen kan brukes til å teste effekten av romanen behandlinger på chondrocyte funksjon og brusk ECM omsetning. En rekke studier har brukt brusk explants å beskrive biologiske prosesser eller effekten av intervensjon på cytokin-utfordret explants bruker kvantitative histologiske eller immunhistokjemiske tilnærminger, mRNA, protein uttrykk, eller Proteomikk2 ,17,18. Disse protokollene er imidlertid utenfor omfanget av det nåværende manuskriptet.
Protokollen som presenteres her for profilering av brusk vev omsetning i storfe brusk explants kan brukes til karakteriserer behandling effekter av mange typer narkotika, inkludert hemmere av inflammatoriske intracellulære trasé, hemmere av proteolytiske enzymer, eller anabole vekstfaktorer.
To forskjellige oppsett ble beskrevet i denne protokollen: en anabole oppsett der explants ble stimulert med insulin-lignende vekstfaktor 1 (IGF-1), og en katabolske oppsett bestående stimulering med TN…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker det tekniske personalet ved Nordic Bioscience for laboratorie støtte, så vel som dansk forskningsstiftelse for generell støtte til forskningen vår.
45% Iron(III) chloride solution | Sigma-Aldrich | 12322 | |
Acetic acid | Merck | 1.00056.2500 | |
Alamar Blue | Life tech Invitrogen | DAL1100 | |
Biopsy processing cassettes – green | IHCWORLD | BC-0109G | |
Biopsy punch W/Plunger (3 mm) | Scandidat | MTP-33-32 | |
Bovine cartilage (Bovine knees) | Local slaughterhouse | ||
C2M | Nordic Bioscience | Fee for service | |
Corning 96-well plate | Sigma-Aldrich | CLS7007 | |
Cover Glass Ø 13 mm | VWR | 631-0150P | |
DMEM/F12-GlutaMAX Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) without HEPES | Gibco | 31331-028 | |
Ethanol ≥96% | VWR | 83804.36 | |
Ethanol absolute ≥99.5% | VWR | 83813.36 | |
exAGNx1 | Nordic Bioscience | Fee for service | |
exPRO-C2 | Nordic Bioscience | Fee for service | |
Fast green | Sigma-Aldrich | F7252 | |
Formaldehyde solution 4% | Merck | 1004965000 | |
GM6001 | Sigma-Aldrich | M5939-5MG | |
Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H3136 | |
Hydrochloric acid | Merck | 30721-M | |
IGF-1 | Sigma-Aldrich | I3769-50UG | |
Oncostatin M | Sigma-Aldrich | O9635-10UG | |
Penicillin-streptomycin (P/S) | Sigma-Aldrich | P4333 | |
Pertex (mounting medium for light microscopy) | HistoLab | 811 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
Safranin O | Sigma-Aldrich | S2255 | |
Sterile Standard Scalpels | Integra Miltex | 12-460-451 | |
Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 30743 | |
SUPERFROST PLUS Adhesion Microscope Slides | Thermo scientific | J1800AMNT | |
TNF-alpha | R&D Systems | 210-TA-100 | |
Toluene | Merck | 1.08327.2500 | |
Vacuum Filtration "rapid"-Filtermax | TPP | 99955 |