En ex vivo tissue kultur modell av brusk remodeling i storfe kne Explants

Summary

Her presenterer vi en protokoll som beskriver isolering og dyrking av brusk explants fra storfe knær. Denne metoden gir et enkelt og tilgjengelig verktøy for å beskrive vevs endringer som følge av biologiske stimuli eller nye legemiddel selskap som er målrettet mot leddet.

Abstract

Ex vivo kultur systemer dekker et bredt spekter av eksperimenter dedikert til å studere vev og cellulær funksjon i en innfødt setting. Brusk er et unikt vev viktig for riktig funksjon av synovial felles og er konstituert av en tett ekstracellulære matrise (ECM), rik på proteoglycan og type II kollagen. Chondrocytes er den eneste celletypen som finnes i brusk og er utbredt og relativt lav i antall. Endrede eksterne stimuli og cellulær signal kan føre til endringer i ECM sammensetning og forringelse, som er viktige patologiske kjennetegn i sykdommer som artrose (OA) og revmatoid artritt.

Ex vivo brusk modeller tillate 1) profilering av chondrocyte mediert endringer av brusk vev omsetning, 2) visualisere brusk ECM sammensetning, og 3) chondrocyte omorganisering direkte i vevet. Profilering av disse endringene som svar på stimuli eller behandlinger er av stor betydning i ulike aspekter av brusk biologi, og utfylle in vitro eksperimenter i isolerte chondrocytes, eller mer komplekse modeller i levende dyr der eksperimentelle forhold er vanskeligere å kontrollere.

Brusk explants presentere en translational og lett tilgjengelig metode for å vurdere vev remodeling i brusk ECM i kontrollerbar innstillinger. Her beskriver vi en protokoll for å isolere og dyrking lever storfe brusk explants. Metoden bruker vev fra storfe kneet, som er lett tilgjengelig fra den lokale slakteri. Både explants og conditioned kultur medium kan analyseres for å undersøke vev omsetning, ECM sammensetning, og chondrocyte funksjon, og dermed profilering ECM moduleringshjul.

Introduction

Chondrocytes produsere og vedlikeholde brusk matrise. For å studere biologi av chondrocytes og hvordan de og de omkringliggende ECM reagerer på eksterne stimuli, er det avgjørende å forhøre dem i sitt eget miljø^1,2. Studere brusk omsetning er viktig å øke forståelsen av de underliggende mekanismene i leddsykdommer som OA, en sykdom som det er for tiden ingen sykdom modifisere behandling. Følgelig er det et betydelig behov for bedre oversettelse modeller².

Ex vivo karakterisering av celle-og vevs effekter er viktig å utfylle andre prekliniske modeller, både in vitro, slik som chondrocyte monolag kulturer, og in vivo, som kirurgi-indusert OA modeller eller autoimmune kollagen-indusert artritt modell (CIA ). Tallrike studier har fremhevet forskjellene mellom hvordan cellene oppfører seg i 2D-monolag kulturer og 3D-strukturer eller i sitt eget vev^3,4. Mange celler i 2D lag vedta unaturlig morfologier, inkludert forskjeller i celle polaritet og vev vedlegg, noe som resulterer i både visuelle og funksjonelle forskjeller i celler innen native vev⁵. Forskjellene er også tydelig i funksjonaliteten til cellene, som kan skifte protein uttrykk, som fører til dypt endrede differensiering mønstre, regulatoriske maskiner, og celle funksjonalitet^{5,6,7 ,8}.

Brusk ECM består hovedsakelig av type II kollagen som gir en matrise rammeverk, og aggrecan, en proteoglycan som bidrar til å beholde væske i vevet. Andre Matrix molekyler som kollagen type IV, VI, IX, X, XI, XII, fibronektin, brusk oligomer protein (COMP), biglycan, decorin, og perlecan er også til stede⁹.

Mens etiologi av OA er fortsatt uklart^10,11, er utbruddet av sykdommen antas å være forårsaket av ubalanser i vev omsetning og reparasjonsprosesser^12,13. Nedbrytning av ledd brusk er et kjennetegn på OA. Brusk-Resident chondrocytes eller celler i omkringliggende vev øke sin frigjøring av cytokiner, stimulere forhøyet produksjon av proteinaser som matrise metalloproteinases (MMPs) og aggrecanases, som øker nedbrytning av brusk ECM ¹⁴. denne degradering resulterer i utgivelsen av små unike protein fragmenter kalt neo-epitopes, som kan kvantifisert i serum, urin, eller kultur medium¹⁵. Ved dannelse og modning av kollagen, såkalte profragments er også utgitt; Disse kan være kvantifisert som et mål på matrise produksjon¹⁶.

Målet med denne protokollen er å etablere en ex vivo brusk modell for å sammenligne effekten av stimulering og/eller narkotikabehandling på ECM vev omsetning. Brusk omsetning er profilert ved å måle matrise-avledet neo-epitope biomarkører direkte i betinget kultur medium bruker ELISA: AGNx1 (reflekterende aggrecanase aktivitet), C2M (reflekterende matrise MMP aktivitet), og ProC2 (reflekterende type II kollagen og formasjon). Funnene kan verifiseres ved histologiske farging av ECM, som også visualiserer organiseringen av chondrocytes i den enkelte explants. Den beskrevne protokollen kan brukes til å teste effekten av romanen behandlinger på chondrocyte funksjon og brusk ECM omsetning. En rekke studier har brukt brusk explants å beskrive biologiske prosesser eller effekten av intervensjon på cytokin-utfordret explants bruker kvantitative histologiske eller immunhistokjemiske tilnærminger, mRNA, protein uttrykk, eller Proteomikk^{2 ,17,18}. Disse protokollene er imidlertid utenfor omfanget av det nåværende manuskriptet.

Protocol

1. vevs isolasjon Vev sourcing Utfør hele vevs genererings delen utenfor en laminær i et aseptisk miljø. Fra den lokale slakteri, få en hel fersk storfe tibiofemoral kneleddet fra kalver mellom 1,5 og 2 år. Forsiktig analysere kalven kneet ved først å fjerne overflødig kjøtt, avdekke Kondyler, menisk, sener, og synovial membran. Skjær sener og synovial membran, slik at skjøten til dismember. Fjern menisk for å avdekke lår Kondyler. Isoler explants fra bære …

Representative Results

Full dybde explants ble isolert, kultivert og behandlet i 3 uker (figur 1). Kulturen medium ble endret med tillegg av behandling 3 ganger per uke. Når ukentlig, metabolsk aktivitet ble målt ved resazurin analysen. Biomarkører av ECM-omsetning ble målt i supernatanten høstet fra kultur platen 3 ganger per uke. Explants ble delt inn i 4 grupper for behandling: 1) Oncostatin M og TNFα (O + T); 2) O + T + GM6001 (GM6001); 3) insulin som vekstfaktor-1 (IGF-1); og 4) en kontroll uten behandl…

Discussion

Protokollen som presenteres her for profilering av brusk vev omsetning i storfe brusk explants kan brukes til karakteriserer behandling effekter av mange typer narkotika, inkludert hemmere av inflammatoriske intracellulære trasé, hemmere av proteolytiske enzymer, eller anabole vekstfaktorer.

To forskjellige oppsett ble beskrevet i denne protokollen: en anabole oppsett der explants ble stimulert med insulin-lignende vekstfaktor 1 (IGF-1), og en katabolske oppsett bestående stimulering med TN…

Materials

45% Iron(III) chloride solution	Sigma-Aldrich	12322
Acetic acid	Merck	1.00056.2500
Alamar Blue	Life tech Invitrogen	DAL1100
Biopsy processing cassettes – green	IHCWORLD	BC-0109G
Biopsy punch W/Plunger (3 mm)	Scandidat	MTP-33-32
Bovine cartilage (Bovine knees)	Local slaughterhouse
C2M	Nordic Bioscience		Fee for service
Corning 96-well plate	Sigma-Aldrich	CLS7007
Cover Glass Ø 13 mm	VWR	631-0150P
DMEM/F12-GlutaMAX Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) without HEPES	Gibco	31331-028
Ethanol ≥96%	VWR	83804.36
Ethanol absolute ≥99.5%	VWR	83813.36
exAGNx1	Nordic Bioscience		Fee for service
exPRO-C2	Nordic Bioscience		Fee for service
Fast green	Sigma-Aldrich	F7252
Formaldehyde solution 4%	Merck	1004965000
GM6001	Sigma-Aldrich	M5939-5MG
Hematoxylin	Sigma-Aldrich	H3136
Hydrochloric acid	Merck	30721-M
IGF-1	Sigma-Aldrich	I3769-50UG
Oncostatin M	Sigma-Aldrich	O9635-10UG
Penicillin-streptomycin (P/S)	Sigma-Aldrich	P4333
Pertex (mounting medium for light microscopy)	HistoLab	811
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
Safranin O	Sigma-Aldrich	S2255
Sterile Standard Scalpels	Integra Miltex	12-460-451
Sulfuric acid	Sigma-Aldrich	30743
SUPERFROST PLUS Adhesion Microscope Slides	Thermo scientific	J1800AMNT
TNF-alpha	R&D Systems	210-TA-100
Toluene	Merck	1.08327.2500
Vacuum Filtration "rapid"-Filtermax	TPP	99955