Vorbereitung und Anwendung eines neuen bakteriellen Biosensors für die präventive Erkennung von Gunshot Residue
Summary
Ein Protokoll wird mit synthetischen Biologie-Techniken vorgestellt, um eine Reihe von bakteriellen Biosensoren zur Analyse von Schussrückständen zu synthetischen Biologiesensoren zu synthetisch zu synthetisch zu synthetisch zu synthetisch zu synthetisch zu synthetisch zu synthetischen Sensoren zu synthetisch zu synthetisch zu synthetisch zu synthetisieren und die Funktionsweise der Geräte mit Hilfe der Fluoreszenzspektroskopie auf ihren beabsichtigten Einsatz zu testen.
Abstract
MicRoboCop ist ein Biosensor, der für eine einzigartige Anwendung in der forensischen Chemie entwickelt wurde. MicRoboCop ist ein System, das aus drei Geräten besteht, die, wenn sie zusammen verwendet werden, das Vorhandensein von Schussrückständen (GSR) anzeigen können, indem sie ein Fluoreszenzsignal in Anwesenheit von drei Schlüsselanalyten (Antimon, Blei und organische Komponenten der GSR) erzeugen. Das Protokoll beschreibt die Synthese der Biosensoren mit Escherichia coli (E. coli) und die analytischen Methoden der Chemie, mit denen die Selektivität und Empfindlichkeit der Sensoren bewertet wird. Die Funktionsweise des Systems wird durch die Verwendung von GSR aus dem Inneren eines verbrauchten Patronenhülers gesammelt. Nach der Vorbereitung können die Biosensoren bis zum Bedarf gespeichert und als Test für diese Schlüsselanalysen verwendet werden. Eine positive Resonanz aller drei Analyten liefert einen voraussichtlichen positiven Test für GSR, während jedes einzelne Gerät Anwendungen zur Erkennung der Analyten in anderen Proben (z.B. ein Detektor für Bleikontamination im Trinkwasser) hat. Die Haupteinschränkung des Systems ist die Zeit, die für ein positives Signal erforderlich ist; In Zukunft kann es sein, verschiedene Organismen zu untersuchen, um die Reaktionszeit zu optimieren.
Introduction
Ein Biosensor ist jedes Analysegerät, das biologische Komponenten (wie Proteine, Nukleinsäuren oder ganze Organismen) verwendet, die eine Reaktion erzeugen, die zur Erkennung einer chemischen Substanz oder eines Analyten verwendet werden kann. Zum Beispiel nutzte der Kohlebergbau einen Biosensor für einen Großteil des 20. Jahrhunderts, um das Vorhandensein giftiger Minengase zu erkennen: Den Kanarienvogel in der Kohlemine1. Die Reaktion des biologischen Organismus (Tod oder Bedrängnis) auf einen chemischen Analyten (Kohlenmonoxid) wurde von den Bergarbeitern beobachtet, um die Arbeiter zu schützen. In einem moderneren und ausgeklügelteren Beispiel können Bakterien mit synthetischen Biologie-Techniken verändert werden, um auf das Vorhandensein eines bestimmten chemischen Analyten zu reagieren, indem eine spezifische Reaktion, wie die Expression eines fluoreszierenden Proteins, angezeigt wird.
Die synthetische Biologie ist ein breiter Begriff, der sich auf den Bau biologischer Geräte und Systeme bezieht, die nicht auf natürliche Weise existieren, oder auf die Neugestaltung bestehender biologischer Systeme für einen bestimmten Zweck2. Die synthetische Biologie unterscheidet sich von der Gentechnik durch eine Standardmethodik und das Vorhandensein standardisierter Teile (Standard-synthetische Biologie-genetische Elemente), die zur Synthese von Geräten und Systemenverwendet werden können. Ein Teil wird in das Genom eines Gerätes,eines Organismus wie eines Bakteriums, eingeführt, um ein bestimmtes Merkmal auszudrücken, das als Funktionsindikation dienen wird. So wird bei vielen synthetischen Geräten der Ausdruck eines fluoreszierenden Proteins als Reporter-Protein in einen einzigen zellenden Organismus eingeführt. Mehrere Geräte können zu einem Systemkombiniert werden. Die Genome von Mikroorganismen wie Bakterien lassen sich auf diese Weise leicht manipulieren. In den letzten zehn Jahren wurden in der Literatur zahlreiche Beispiele von Biosensoren berichtet,dieauf eine VielzahlchemischerAnalyten zugeschnitten sind.
In dieser Arbeit wird das MicRoboCop-System als Beispiel für einen Biosensor präsentiert, der mit synthetischen Biologie-Techniken mit neuartigen Anwendungen in der forensischen und ökologischen Chemie entwickelt wurde. MicRoboCop ist ein System von drei separaten Geräten, die, wenn sie kombiniert werden, es Escherichia coli ermöglichen, rotes fluoreszierendes Protein (RFP) in Anwesenheit von Schussrückständen (GSR) auszudrücken, die aus den Händen einer Person oder einer Oberfläche gesammelt wurden. Jedes der drei Geräte reagiert auf einen spezifischen chemischen Analyten, der als Bestandteil von GSR5bekannt ist. Die drei Analyten, auf die das System reagiert, sind I. 2,4,6-trinitrotoluene (TNT) und verwandte Verbindungen, II. Blei (in Form von Blei-Ionen), und III. Antimon (auch in Form von Ionen).
GSR besteht aus vielen verschiedenen chemischen Substanzen, aber die drei, die normalerweise verwendet werden, um einen Rückstand zu identifizieren, wie GSR sind Barium, Blei und Antimon5. Der Standard-Nachweistest zur Identifizierung von GSR ist die Verwendung von Rasterelektronenmikroskopie (SEM) mit energiedispergierender Röntgenfluoreszenz (EDX)5. SEM-EDX ermöglicht es Analysten, die einzigartigen Morphologie und die Elementarkomponenten der GSR zu identifizieren. Derzeit gibt es nur wenige weit verbreitete binäre Anmaßungstests zur Verfügung. In einem kürzlich veröffentlichten Präsenztest wird die Ionenbewegungsspektroskopie (IMS) verwendet, die spezialisierte Geräte ist, die in vielen Labors6nicht verfügbar sein könnten. Es gibt auch ein paar farbige “Spot”-Tests, die verwendet werden können, obwohl sie in der Regel für die Distanzbestimmung oder für die GSR-Identifikation auf Einschusslöchern und Wunden 5 verwendet werden. Darüber hinaus gab es in der Literatur eine begrenzte Aufmerksamkeit für elektrochemische Tests für GSR, die voltammetrische Analyse, die den Vorteil hat, dass potenziell Feld tragbar ist, oder anodic Stripping Voltammetry, die eine extrem Empfindliche Methode für metallische Elemente7. In der Literatur von Biosensoren, die speziell für die Erkennung von GSR entwickelt wurden, wird nur sehr wenig erwähnt, obwohl einige Biosensoren für andere forensische Anwendungen veröffentlicht wurden8.
Die biologischen Elemente für jedes Gerät im MicRoboCop-System und die Plasmid-Konstruktion sind in Abbildung1 dargestellt. Der geschwungene Pfeil in Abbildung 1b stellt die Promoter-Region dar, die in Anwesenheit des Analyten aktiviert wird, das Oval ist die ribosomale Bindungsstelle, die die Übersetzung des Reporter-Proteins ermöglicht, die graue Box mit der Bezeichnung RFP ist das Gen, das Rot drückt Fluoreszierendes Protein, und das rote Achteck ist die Transkriptionsabbruchstelle. Alle drei Geräte werden zusammen als System zur Erkennung von GSR eingesetzt. Jedes Gerät mit einem bestimmten Promoter (SbRFP, PbRFP und TNT-RFP) wird mit der Probe, die getestet wird, inkubiert und die Fluoreszenz von RFP wird gemessen. RFP wird nur dann zum Ausdruck gebracht, wenn der entsprechende chemische Analyt vorhanden ist und die Promoterregion aktiviert wird. Drei Geräte, die auf einige der in GSR vorhandenen chemischen Substanzen reagieren, wurden entworfen und werden in dieser Arbeit vorgestellt.
Die Promoter, die in den drei MicRoboCop-Geräten eingesetzt werden, sind ein arsen-und antimonempfindlicher Promoter, SbRFP 9 , 10,ein bleisensibler Promoter, PbRFP11, 12und ein TNT-sensibler Promoter, TNT-RFP 13. Da eine Suche in der Literatur keinen Promoter ergab, der darauf reagiert, wurde stattdessen der TNT-Promoter ausgewählt, da dieser Promoter empfindlich auf eine Reihe von strukturell verwandten Verbindungen reagiert (insbesondere 2,4-Dinitrotoluene und Dinitrobenzol), die als Teil der organischen Verbindungen bekannt sind, die in der GSR zurückgelassen werden. Dieser Projektträger wurde erfolgreich eingesetzt, um in vergrabenen Landminen 13 Minenmengen von TNT und 2,4-Dinitrotoluol (2,4-DNT) gezielt zu erkennen. Mit den drei Geräten gemeinsam als System wird ein positiver Test für GSR in allen drei Geräten Fluoreszenz erzeugen. Ein Fluoreszenzsignal in nur einem oder zwei Geräten zeigt eine andere Umweltquelle der Analyten oder im Fall des TNT-Promoters an, die Aktivierung durch eine Verbindung, die keine organische Verbindung ist, die in GSR zurückgelassen wird. Durch die gemeinsame Nutzung aller drei Geräte wird die Möglichkeit eines falschen positiven Ergebnisses aufgrund von Umweltquellen minimiert. Bleifreie Munition, die an Popularität gewinnt, macht immer noch nur etwa 5% des Munitionsverkaufs in den USA aus; Daher können falsche negative Ergebnisse aufgrund des Fehlens von Blei möglich sein, aber es gibt immer noch einen Nutzen in einem Sensor, der Blei als Markerfür GSR 14 verwendet. Zusätzlich zu dieser speziellen forensischen Anwendung kann jedes Gerät separat zur Erkennung von Umweltbelastungen eingesetzt werden.
Zu den vorgestellten Protokollen gehören die synthetischen Biologietechniken, mit denen die Geräte (Sensorbakterien) erstellt werden, und die Analysetechniken, um die Funktion der Geräte zu überprüfen und die erhaltenen Fluoreszenzsignale zu analysieren. Das Protokoll umfasst auch die Sammlung von forensischen Beweisen in Form von Handwischungen, um GSR aus den Händen eines Verdächtigen oder Swabbing zu sammeln, um GSR von einer Oberfläche zu sammeln. Die Ergebnisse des Bleisensor-Gerätes werden als Beispielresultate dargestellt, zusammen mit der Demonstration eines positiven Tests für GSR mit einem verbrauchten Patronengehäuse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Änderungen und Fehlerbehebungen
Das in Tabelle 4 beschriebene Experiment kann in jeder Weise modifiziert werden, die den entworfenen Sensoren entspricht. Der wichtigste Aspekt eines chemischen Sensors ist die Bewertung seiner Empfindlichkeit und Spezifität. Es ist von Vorteil, dass eine Vielzahl von Konzentrationen des Analyten analysiert wird, um den nützlichen Analysebereich des Sensors zu bestimmen. Es lohnt sich auch, ein Maximum an Analyte für die Zel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten die Studenten der Longwood University in BIOL 324 (Genetics) und die Studierenden von CHEM 403 (Advanced Chemical Laboratory Problem Solving) würdigen, die an der ersten Vorbereitung und Erprobung der Antimonie-und Bleibiosensoren beteiligt waren. Die Idee für MicRoboCop entstand auf dem GCAT SynBIO-Workshop (Sommer 2014), der vom NSF und Howard Hughes Medical Institute finanziert und von der University of Maryland Baltimore County veranstaltet wird. Die Autoren bestätigen auch die Förderung, die sie von der Cook-Cole College of Arts and Sciences der Longwood University und dem GCAT SynBio Alumni Grant erhalten haben.
Materials
| 1,3-dinitrobenzene, 97% | Aldrich | D194255-25G | |
| 2,4-dinitrotoluene, 97% | Aldrich | 101397-5G | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-500 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Antimony, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified) | Fisher Scientific | SA450-100 | Standard in dilute HNO3 |
| Cut Smart Buffer | New England BioLabs | B7204S | |
| Duplex Buffer | Integrated DNA Technologies | 11-01-03-00 | |
| EcoRI-HF Restriction Enzyme | New England BioLabs | R3101S | |
| Ethanol, HPLC grade, denatured | Acros Organics | AC611050040 | Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work. |
| Eurofins Genomics SimpleSeq DNA Sequencing Kits | Eurofins Genomics | SimpleSeq Kit Standard | |
| Forward primer for colony PCR | Integrated DNA Technologies | 5’- GCCGCTTGAATTCGTCATATAT-3’ | |
| Forward primer for DNA sequencing | Integrated DNA Technologies | 5’- GTAAAACGACGGCCAGTG-3’ | |
| IBI Science High Speed Plasmid Mini-kit | IBI Scientific | IB47101 | |
| LB Broth, Miller | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
| Lead, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified) | Fisher Scientific | SL21-100 | Standard in dilute HNO3 |
| LeadOff Disposable Cleaning and Decon Wipes | Hygenall | 45NRCN | Sold in canisters or individually wrapped, any alcohol based wipe will work. |
| Methanol, HPLC grade | Fisher Scientific | A452-4 | Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work. |
| NEB 5-alpha Competent E. coli cells | New England BioLabs | C2987I | |
| NheI-HF Restriction Enzyme | New England BioLabs | R3131S | |
| Nuclease free water | New England BioLabs | B1500S | |
| OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer | New England BioLabs | M0482S | |
| Plasmids from the registry of standard biological parts used for synthetic biology | Registry of Standard Biological Parts | http://parts.igem.org/Main_Page | |
| Promoter Sequences | Integrated DNA Technologies | Sb promoter: 5’-GCATGAATTCAGTCAT ATATGTTTTTGACTTATCCGCTTCGAAGAGAG AGACACTACCTGCAACAATCGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCTCACTATATACAAAAACT GAATAGGCGAAGCTTCTCTCTCTGTGATGGAC GTTGTTAGCGATCGCGTA-5’ Pb promoter: 5’-GCATGAATTCGTCTTG ACTCTATAGTAACTAAGGGTGTATAATCGGCA ACGCGAGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCAGAACTGAGATATCATTG ATCTCCCACATCTTAGCCGTTGCGCTGCGATCGCGTA-5’ TNT promoter: 5’GCATTCTAGATCAATT TATTTGAACAAGGCGGTCAATTCTCTTCGATT TTATCTCTCGTAAAAAAACGTGATACTCATCA CATCGACGAAACAACGTCACTTATACAAAAAT CACCTGCGAGAGATTAATTGAATTCGCAT3’ 3’CGTAAGATCTAGTTAAATAAACTTGTTCCG CCAGTTAAGAGAAGCTAAAATAGAGAGCATTT TTTTGCACTATGAGTAGTGTAGCTGCTTTGTT GCAGTGAATATGTTTTTAGTGGACGCTCTCTA ATTAACTTAAGCGTA5’ |
|
| Reverse primer for colony PCR | Integrated DNA Technologies | 5’- GCCGCTTGAATTCGTCTAGACT- 3’ | |
| Reverse primer for DNA sequencing | Integrated DNA Technologies | 5’- GGAAACAGCTATGACCATG-3’ | |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S |
References
- Eschner, K. "The Story of the Real Canary in the Coal Mine.". The Smithsonian Magazine. , (2016).
- Roda, A., et al. Progress in chemical luminescence-based biosensors: A critical review. Biosensors & Bioelectronics. 76, 164-179 (2016).
- He, W., Yuan, S., Zhong, W. H., Siddikee, M. A., Dai, C. C. Application of genetically engineered microbial whole-cell biosensors for combined chemosensing. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (3), 1109-1119 (2016).
- Dalby, O., Butler, D., Birkett, J. W. Analysis of Gunshot Residue and Associated Materials-A Review. Journal of Forensic Sciences. 55 (4), 924-943 (2010).
- Bell, S., Seitzinger, L. From binary presumptive assays to probabilistic assessments: Differentiation of shooters from non-shooters using IMS, OGSR, neural networks, and likelihood ratios. Forensic Science International. 263, 176-185 (2016).
- O'Mahony, A. M., Wang, J. Electrochemical Detection of Gunshot Residue for Forensic Analysis: A Review. Electroanalysis. 25 (6), 1341-1358 (2013).
- Vigneshvar, S., Sudhakumari, C. C., Senthilkumaran, B., Prakash, H. Recent Advances in Biosensor Technology for Potential Applications – An Overview. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 9 (2016).
- Fernandez, M., Morel, B., Ramos, J. L., Krell, T. Paralogous Regulators ArsR1 and ArsR2 of Pseudomonas putida KT2440 as a Basis for Arsenic Biosensor Development. Applied and Environmental Microbiology. 82 (14), 4133-4144 (2016).
- Porter, S. E. G., Barber, A. E., Colella, O. K., Roach, T. D. Using Biological Organisms as Chemical Sensors: The MicRoboCop Project. Journal of Chemical Education. 95 (8), 1392-1397 (2018).
- Borremans, B., Hobman, J. L., Provoost, A., Brown, N. L., Van der Lelie, D. Cloning and functional analysis of the pbr lead resistance determinant of Ralstonia metallidurans CH34. Journal of Bacteriology. 183 (19), 5651-5658 (2001).
- Hobman, J. L., Julian, D. J., Brown, N. L. Cysteine coordination of Pb(II) is involved in the PbrR-dependent activation of the lead-resistance promoter, PpbrA, from Cupriavidus metallidurans CH34. Bmc Microbiology. 12, (2012).
- Yagur-Kroll, S., Amiel, E., Rosen, R., Belkin, S. Detection of 2,4-dinitrotoluene and 2,4,6-trinitrotoluene by an Escherichia coli bioreporter: performance enhancement by directed evolution. Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (17), 7177-7188 (2015).
- Gorman, M. "Guns in America: The Debate Over Lead Based Bullets.". Newsweek. , (2017).
- Yuksel, B., Ozler-Yigiter, A., Bora, T., Sen, N., Kayaalti, Z. GFAAS Determination of Antimony, Barium, and Lead Levels in Gunshot Residue Swabs: An Application in Forensic Chemistry. Atomic Spectroscopy. 37 (4), 164-169 (2016).
- Blakey, L. S., Sharples, G. P., Chana, K., Birkett, J. W. Fate and Behavior of Gunshot Residue-A Review. Journal of Forensic Sciences. 63 (1), 9-19 (2018).
- Yagur-Kroll, S., et al. Escherichia coli bioreporters for the detection of 2,4-dinitrotoluene and 2,4,6-trinitrotoluene. Applied Microbiology and Biotechnology. 98 (2), 885-895 (2014).
