तैयारी और बंदूक की गोली अवशेष का अनुमान लगाने के लिए एक नया बैक्टीरियल Biosensor के आवेदन
Summary
एक प्रोटोकॉल सिंथेटिक जीव विज्ञान तकनीकों का उपयोग कर बंदूक की गोली अवशेषों के विश्लेषण के लिए बैक्टीरियल बायोसेंसर का एक सेट synthesize करने के लिए प्रस्तुत किया है, और प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग कर उनके उद्देश्य का उपयोग करने के लिए उपकरणों के कामकाज का परीक्षण करने के लिए.
Abstract
माइक्रोबोकॉप एक बायोसेंसर है जिसे फोरेंसिक केमिस्ट्री में एक अनोखे एप्लीकेशन के लिए डिजाइन किया गया है । माइक्रोबोकॉप एक प्रणाली है, जो तीन उपकरणों से बनी है, जब एक साथ प्रयोग किया जाता है, तीन कुंजी एनालेट्स (ऐन्टिमनी, लेड, और जीएसआर के कार्बनिक घटकों) की उपस्थिति में प्रतिदीप्ति संकेत के उत्पादन द्वारा गनशॉट अवशेषों (जीएसआर) की उपस्थिति का संकेत दे सकता है । प्रोटोकॉल का वर्णन बायोसेंसर का उपयोग कर escherichia कोलाई (ई. कोलाई), और विश्लेषणात्मक रसायन विज्ञान के लिए प्रयोग किया जाता है और सेंसरों की संवेदनशीलता का मूल्यांकन करने के तरीके । प्रणाली के कामकाज के एक खर्च कारतूस आवरण के अंदर से एकत्र GSR का उपयोग करके प्रदर्शन किया है । एक बार तैयार है, बायोसेंसर की जरूरत है जब तक संग्रहीत किया जा सकता है और इन कुंजी analytes के लिए एक परीक्षण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । सभी तीन analytes से एक सकारात्मक प्रतिक्रिया GSR के लिए एक प्रकल्पित सकारात्मक परीक्षण प्रदान करता है, जबकि प्रत्येक व्यक्ति डिवाइस अंय नमूनों में analytes का पता लगाने के लिए आवेदन किया है (उदाहरण के लिए, पीने के पानी में सीसा संदूषण के लिए एक डिटेक्टर) । प्रणाली की मुख्य सीमा एक सकारात्मक संकेत के लिए आवश्यक समय है; भावी कार्य में अनुक्रिया समय को इष्टतम करने के लिए विभिन्न जीवों का अध्ययन शामिल हो सकता है ।
Introduction
एक बायोसेंसर किसी भी विश्लेषणात्मक उपकरण है कि जैविक घटकों (जैसे प्रोटीन, न्यूइक एसिड, या पूरे जीवों) का उपयोग करता है कि एक प्रतिक्रिया है कि एक रासायनिक पदार्थ या analyte का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता का उत्पादन है । एक उदाहरण के रूप में, कोयला खनन उद्योग 20 वीं सदी के अधिक के लिए एक बायोसेंसर का इस्तेमाल किया विषाक्त खान गैसों की उपस्थिति का पता लगाने:1कोयला खदान में कनारी । श्रमिकों की सुरक्षा के लिए माइनरों द्वारा जैविक जीव (कैनरी) अनुक्रिया (मृत्यु या कष्ट) को रासायनिक विश्लेषण (कार्बन मोनोऑक्साइड) के रूप में देखा गया । एक और अधिक आधुनिक और परिष्कृत उदाहरण में, बैक्टीरिया एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति के रूप में एक विशिष्ट प्रतिक्रिया, प्रदर्शन द्वारा एक निश्चित रासायनिक analyte की उपस्थिति के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए सिंथेटिक जीव विज्ञान तकनीकों का उपयोग कर बदला जा सकता है ।
सिंथेटिक जीवविज्ञान एक व्यापक शब्द है कि जैविक उपकरणों और प्रणालियों है कि स्वाभाविक रूप से मौजूद नहीं है, या एक विशिष्ट प्रयोजन के लिए मौजूदा जैविक प्रणालियों के फिर से डिजाइन के निर्माण को संदर्भित करता है2है । सिंथेटिक जीव विज्ञान एक मानक पद्धति और मानकीकृत भागों (मानक सिंथेटिक जीव विज्ञान आनुवंशिक तत्वों) है कि उपकरणों और प्रणालियोंsynthesize करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के अस्तित्व के द्वारा जेनेटिक इंजीनियरिंग से प्रतिष्ठित है । एक अंग को एक उपकरणके जीनोम में पेश किया जाता है, जो एक जीवाणु के रूप में होता है, एक ऐसा लक्षण व्यक्त करने के लिए जो फलन के संकेत के रूप में कार्य करेगा । उदाहरण के लिए, कई सिंथेटिक उपकरणों में, एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति एक एक कोशिकीय जीव में एक रिपोर्टर प्रोटीन के रूप में शुरू की है । कई उपकरणों को एक प्रणालीमें जोड़ा जा सकता है । सूक्ष्मजीवों जैसे जीवाणुओं के जीनोम इस तरीके से हेरफेर करने के लिए आसान कर रहे हैं । रासायनिक analytes की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए विशिष्ट बायोसेंसर के कई उदाहरण के पिछले एक दशक से अधिक साहित्य में रिपोर्ट किया गया है3,4।
इस काम में, माइक्रोबोकॉप प्रणाली एक उदाहरण के रूप में प्रस्तुत किया है एक बायोसेंसर फोरेंसिक और पर्यावरण रसायन विज्ञान में उपन्यास अनुप्रयोगों के साथ सिंथेटिक जीव विज्ञान तकनीकों का उपयोग कर बनाया गया. MicRoboCop तीन अलग उपकरणों की एक प्रणाली है कि, जब संयुक्त, एक व्यक्ति के हाथ या एक सतह से एकत्र किया गया है कि बंदूक की गोली अवशेषों (GSR) की उपस्थिति में लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (RFP) व्यक्त करने के लिए Escherichia कोलाई की अनुमति देगा । तीन उपकरणों में से प्रत्येक के लिए एक विशिष्ट रासायनिक analyte कि GSR5के एक घटक होने के लिए जाना जाता है का जवाब । तीन analytes जो प्रणाली का जवाब है I .2, 4, 6-trinitrotoluene (टीएनटी) और संबंधित यौगिकों, द्वितीय । सीसा (सीसा आयनों के रूप में), और III । ऐन्टिमनी (आयनों के रूप में भी) ।
जीएसआर में कई विभिन्न रासायनिक पदार्थ होते हैं, लेकिन तीन आम तौर पर जीएसआर के रूप में एक अवशेष की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जाता है बेरियम, सीसा, और ऐन्टिमनी5. जीएसआर की पहचान के लिए मानक evidentiary टेस्ट ऊर्जा परिक्षेपी एक्स-रे प्रतिदीप्ति (edx)5के साथ स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) का उपयोग करने के लिए है । SEM-edx विश्लेषकों अद्वितीय आकारिकी और gsr के मौलिक घटकों की पहचान करने की अनुमति देता है । वर्तमान में, वहां कुछ व्यापक रूप से इस्तेमाल किया द्विआधारी अनुमान उपलब्ध परीक्षण कर रहे हैं । एक हाल ही में प्रकाशित प्रकल्पित परीक्षण आयन-गतिशीलता स्पेक्ट्रोस्कोपी (आईएमएस) का उपयोग करता है, जो विशेष उपकरण है कि कई6प्रयोगशालाओं में उपलब्ध नहीं हो सकता है । वहां भी कर रहे है कुछ रंग “स्पॉट” परीक्षण है कि इस्तेमाल किया जा सकता है, हालांकि वे आम तौर पर दूरी दृढ़ संकल्प के लिए या गोली छेद और5घाव पर gsr पहचान के लिए उपयोग किया जाता है । इसके अतिरिक्त, वहां साहित्य में कुछ सीमित ध्यान दिया गया है gsr के लिए इलेक्ट्रोकेमिकल परीक्षण करने के लिए है कि रोजगार voltammetric विश्लेषण, जो लाभ के संभावित जा रहा है क्षेत्र पोर्टेबल, या ऐनोडी अलग करना voltammetric, जो है एक बहुत धातु तत्वों के लिए संवेदनशील विधि7. Gsr का पता लगाने के उद्देश्य के लिए विशेष रूप से डिजाइन बायोसेंसर के साहित्य में बहुत कम उल्लेख है, हालांकि अन्य फोरेंसिक अनुप्रयोगों के लिए कुछ बायोसेंसर8प्रकाशित किया गया है.
माइक्रोबोकॉप प्रणाली में प्रत्येक उपकरण के लिए जैविक तत्वों, और प्लाज्मिड निर्माण, चित्रा 1में सचित्र हैं. चित्र 1b में वक्र तीर प्रवर्तक क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है जो एनालेटे की उपस्थिति में सक्रिय होता है, अंडाकार राइबोसोमल बाइंडिंग साइट है जो रिपोर्टर प्रोटीन के अनुवाद की अनुमति देता है, ग्रे बॉक्स लेबल RFP वह जीन है जो लाल रंग को अभिव्यक्त करता है । फ्लोरोसेंट प्रोटीन, और लाल अष्टस्थल प्रतिलेखन समाप्ति साइट है । सभी तीन डिवाइस एक साथ एक प्रणाली के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा GSR का पता लगाने के लिए । एक विशिष्ट प्रवर्तक (एसबीआरएफपी, पीबीआरएफपी और टीएनटी-आरएफपी) के साथ प्रत्येक उपकरण का परीक्षण किया जा रहा है और आरएफपी के प्रतिदीप्ति को मापा जाएगा । यदि उपयुक्त रासायनिक विश्लेषण उपस्थित है और प्रवर्तक क्षेत्र को सक्रिय करता है तो आरएफपी ही व्यक्त किया जाएगा । जीएसआर में मौजूद कुछ रासायनिक पदार्थों का जवाब देने वाले तीन उपकरणों को डिजाइन किया गया है और इस काम में प्रस्तुत किया गया है ।
तीन माइक्रोबोकॉप उपकरणों में इस्तेमाल किए जाने वाले प्रमोटर्स में आर्सेनिक और ऐन्टिमनी सेंसिटिव प्रमोटर, एसबीआरएफपी9,10, लेड सेंसिटिव प्रमोटर, पीबीआरएफपी11,12 और टीएनटी सेंसिटिव प्रमोटर है, टीएनटी-आरएफपी 13. क्योंकि साहित्य में एक खोज के लिए बेरियम के जवाब के लिए डिजाइन कोई प्रमोटर नहीं पता चला, tnt प्रमोटर के बजाय चयनित किया गया था क्योंकि यह प्रमोटर संरचनात्मक रूप से संबंधित यौगिकों के एक नंबर के लिए संवेदनशील है (विशेष रूप से, 2, 4-dinitrotoluene और डाइनाइट्रोबेन्जीन) जिसे जीएसआर में पीछे छोड़ कार्बनिक यौगिकों का एक भाग माना जाता है । यह प्रमोटर सफलतापूर्वक टीएनटी की सूक्ष्म मात्रा का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया है और 2, 4-dinitrotoluene (2, 4-DNT) दफन भूमि खानों में13. एक साथ एक प्रणाली के रूप में तीन उपकरणों का उपयोग, जीएसआर के लिए एक सकारात्मक परीक्षण सभी तीन उपकरणों में प्रतिदीप्ति का उत्पादन होगा. केवल एक या दो उपकरणों में एक प्रतिदीप्ति संकेत analyte (ओं) के एक और पर्यावरण के स्रोत का संकेत होगा या टीएनटी प्रमोटर के मामले में, एक यौगिक है कि एक कार्बनिक यौगिक GSR में पीछे छोड़ दिया नहीं है द्वारा सक्रियण. एक साथ सभी तीन उपकरणों का उपयोग करके, पर्यावरण के स्रोतों के कारण एक झूठी सकारात्मक परिणाम की संभावना कम है । नेतृत्व मुक्त गोला बारूद, जो लोकप्रियता में आ रहा है, अभी भी संयुक्त राज्य अमेरिका में गोला बारूद की बिक्री के बारे में केवल 5% का प्रतिनिधित्व करता है; इसलिए, झूठी नकारात्मक परिणाम की अनुपस्थिति के कारण एक संभावना हो सकती है, लेकिन एक संवेदक में अभी भी उपयोगिता है कि GSR14के लिए एक मार्कर के रूप में नेतृत्व का उपयोग करता है. इस विशिष्ट फोरेंसिक आवेदन के अलावा, प्रत्येक डिवाइस पर्यावरण contaminants का पता लगाने के प्रयोजनों के लिए अलग से इस्तेमाल किया जा सकता है ।
प्रस्तुत प्रोटोकॉल सिंथेटिक जीव विज्ञान उपकरणों (सेंसर बैक्टीरिया) और विश्लेषणात्मक तकनीकों उपकरणों के समारोह की जांच करने के लिए और प्रतिदीप्ति प्राप्त संकेतों का विश्लेषण बनाने के लिए इस्तेमाल किया तकनीकों में शामिल हैं । प्रोटोकॉल भी एक सतह से GSR इकट्ठा करने के लिए एक संदिग्ध या swabbing के हाथों से GSR इकट्ठा करने के लिए हाथ पोंछते के रूप में फोरेंसिक सबूत के संग्रह शामिल है । लीड सेंसर डिवाइस से परिणाम उदाहरण के परिणाम के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं, GSR के लिए एक सकारात्मक परीक्षण के एक प्रदर्शन के साथ एक खर्च कारतूस आवरण का उपयोग.
Protocol
Representative Results
Discussion
संशोधन और समस्या निवारण
सारणी 4 में वर्णित प्रयोग को किसी भी तरह से संशोधित किया जा सकता है जो सेंसर को डिजाइन किया गया है । एक रासायनिक संवेदक का सबसे महत्वपूर्ण पहलू अपनी संवेद?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों को biol ३२४ (जेनेटिक्स) में longwood विश्वविद्यालय में छात्रों को स्वीकार करना चाहते है और chem ४०३ में छात्रों (उंनत रासायनिक प्रयोगशाला समस्या को हल) जो प्रारंभिक तैयारी और ऐन्टिमनी और सीसा biosensors के परीक्षण में शामिल थे । MicRoboCop के लिए विचार GCAT SynBIO कार्यशाला (ग्रीष्मकालीन २०१४), जो NSF और हावर्ड ह्यूजेस चिकित्सा संस्थान द्वारा वित्त पोषित है और मैरीलैंड बाल्टिमोर काउंटी के विश्वविद्यालय द्वारा आयोजित में कल्पना की थी । लेखक भी Longwood विश्वविद्यालय के कुक से प्राप्त धन स्वीकार-कला और विज्ञान और GCAT SynBio पूर्व छात्र अनुदान के कोल कॉलेज ।
Materials
| 1,3-dinitrobenzene, 97% | Aldrich | D194255-25G | |
| 2,4-dinitrotoluene, 97% | Aldrich | 101397-5G | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-500 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Antimony, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified) | Fisher Scientific | SA450-100 | Standard in dilute HNO3 |
| Cut Smart Buffer | New England BioLabs | B7204S | |
| Duplex Buffer | Integrated DNA Technologies | 11-01-03-00 | |
| EcoRI-HF Restriction Enzyme | New England BioLabs | R3101S | |
| Ethanol, HPLC grade, denatured | Acros Organics | AC611050040 | Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work. |
| Eurofins Genomics SimpleSeq DNA Sequencing Kits | Eurofins Genomics | SimpleSeq Kit Standard | |
| Forward primer for colony PCR | Integrated DNA Technologies | 5’- GCCGCTTGAATTCGTCATATAT-3’ | |
| Forward primer for DNA sequencing | Integrated DNA Technologies | 5’- GTAAAACGACGGCCAGTG-3’ | |
| IBI Science High Speed Plasmid Mini-kit | IBI Scientific | IB47101 | |
| LB Broth, Miller | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
| Lead, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified) | Fisher Scientific | SL21-100 | Standard in dilute HNO3 |
| LeadOff Disposable Cleaning and Decon Wipes | Hygenall | 45NRCN | Sold in canisters or individually wrapped, any alcohol based wipe will work. |
| Methanol, HPLC grade | Fisher Scientific | A452-4 | Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work. |
| NEB 5-alpha Competent E. coli cells | New England BioLabs | C2987I | |
| NheI-HF Restriction Enzyme | New England BioLabs | R3131S | |
| Nuclease free water | New England BioLabs | B1500S | |
| OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer | New England BioLabs | M0482S | |
| Plasmids from the registry of standard biological parts used for synthetic biology | Registry of Standard Biological Parts | http://parts.igem.org/Main_Page | |
| Promoter Sequences | Integrated DNA Technologies | Sb promoter: 5’-GCATGAATTCAGTCAT ATATGTTTTTGACTTATCCGCTTCGAAGAGAG AGACACTACCTGCAACAATCGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCTCACTATATACAAAAACT GAATAGGCGAAGCTTCTCTCTCTGTGATGGAC GTTGTTAGCGATCGCGTA-5’ Pb promoter: 5’-GCATGAATTCGTCTTG ACTCTATAGTAACTAAGGGTGTATAATCGGCA ACGCGAGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCAGAACTGAGATATCATTG ATCTCCCACATCTTAGCCGTTGCGCTGCGATCGCGTA-5’ TNT promoter: 5’GCATTCTAGATCAATT TATTTGAACAAGGCGGTCAATTCTCTTCGATT TTATCTCTCGTAAAAAAACGTGATACTCATCA CATCGACGAAACAACGTCACTTATACAAAAAT CACCTGCGAGAGATTAATTGAATTCGCAT3’ 3’CGTAAGATCTAGTTAAATAAACTTGTTCCG CCAGTTAAGAGAAGCTAAAATAGAGAGCATTT TTTTGCACTATGAGTAGTGTAGCTGCTTTGTT GCAGTGAATATGTTTTTAGTGGACGCTCTCTA ATTAACTTAAGCGTA5’ |
|
| Reverse primer for colony PCR | Integrated DNA Technologies | 5’- GCCGCTTGAATTCGTCTAGACT- 3’ | |
| Reverse primer for DNA sequencing | Integrated DNA Technologies | 5’- GGAAACAGCTATGACCATG-3’ | |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S |
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