Preparação e aplicação de um novo biosensor bacteriano para a detecção presuntiva de resíduo de bala
Summary
Um protocolo é apresentado usando técnicas de biologia sintética para sintetizar um conjunto de biossensores bacterianos para a análise de resíduo de pólvora, e para testar o funcionamento dos dispositivos para seu uso pretendido usando espectroscopia de fluorescência.
Abstract
MicRoboCop é um biosensor que foi projetado para uma aplicação única em química forense. O MicRoboCop é um sistema constituído por três dispositivos que, quando utilizados em conjunto, podem indicar a presença de resíduo de pólvora (GSR) produzindo um sinal de fluorescência na presença de três analitos-chave (antimônio, chumbo e componentes orgânicos da GSR). O protocolo descreve a síntese dos biossensores utilizando Escherichia coli (e. coli), e os métodos de química analítica utilizados para avaliar a seletividade e a sensibilidade dos sensores. O funcionamento do sistema é demonstrado usando GSR coletado do interior de uma carcaça gasta do cartucho. Uma vez preparados, os biossensores podem ser armazenados até que seja necessário e podem ser usados como um teste para esses principais analitos. Uma resposta positiva de todos os três analitos fornece um teste positivo presuntivo para o GSR, quando cada dispositivo individual tiver aplicações para detectar os analitos em outras amostras (por exemplo, um detetor para a contaminação da ligação na água bebendo). A principal limitação do sistema é o tempo necessário para um sinal positivo; trabalho futuro pode envolver o estudo de diferentes organismos para otimizar o tempo de resposta.
Introduction
Um biosensor é qualquer dispositivo analítico que utiliza componentes biológicos (tais como proteínas, ácidos nucleicos ou organismos inteiros) que produzem uma resposta que pode ser usada para a detecção de uma substância química ou analito. Como exemplo, a indústria de mineração de carvão usou um biosensor para grande parte do século 20 para detectar a presença de gases tóxicos da mina: o canário na mina de carvão1. A resposta do organismo biológico (canário) (morte ou angústia) a um analito químico (monóxido de carbono) foi observada pelos mineiros, a fim de proteger os trabalhadores. Em um exemplo mais moderno e sofisticado, as bactérias podem ser alteradas usando técnicas de biologia sintética para responder à presença de um determinado analisador químico, exibindo uma resposta específica, como a expressão de uma proteína fluorescente.
A biologia sintética é um termo amplo que se refere à construção de dispositivos e sistemas biológicos que não existem naturalmente, ou o redesenho de sistemas biológicos existentes para uma finalidade específica2. A biologia sintética distingue-se da engenharia genética por uma metodologia padrão e pela existência de peças padronizadas (elementos genéticos de biologia sintética padrão) que podem ser usadas para sintetizar dispositivos e sistemas. Uma parte é introduzida no genoma de um dispositivo, um organismo como uma bactéria, para expressar uma certa característica que servirá como uma indicação de função. Por exemplo, em muitos dispositivos sintéticos, a expressão de uma proteína fluorescente é introduzida em um único organismo unicelulares como uma proteína do repórter. Vários dispositivos podem ser combinados em um sistema. Os genomas dos micro-organismos tais como as bactérias são fáceis de manipular desta maneira. Vários exemplos de biosensores específicos para uma ampla gama de analisadores químicos têm sido relatados na literatura na última década3,4.
Neste trabalho, o sistema MicRoboCop é apresentado como um exemplo de um biosensor projetado usando técnicas de biologia sintética com novas aplicações em química forense e ambiental. MicRoboCop é um sistema de três dispositivos separados que, quando combinados, permitirão que Escherichia coli expresse a proteína vermelha fluorescente (RFP) na presença de resíduo de bala (GSR) que foi coletado das mãos de uma pessoa ou de uma superfície. Cada um dos três dispositivos responde a um analito químico específico que seja sabido para ser um componente de GSR5. Os três analitos aos quais o sistema responde são I. 2, 4, 6-trinitrotolueno (TNT) e compostos relacionados, II. chumbo (sob a forma de íons de chumbo), e III. antimônio (também a forma de íons).
GSR consiste em muitas substâncias químicas diferentes, mas os três usados geralmente para identificar um resíduo como GSR são bário, ligação, e antimônio5. O teste probatório padrão para a identificação de GSR é usar a microscopia de elétron de exploração (sem) com fluorescência dispersiva da energia do raio X (EDX)5. O SEM-EDX permite que os analistas identifiquem a morfologia única e os componentes elementares da GSR. Atualmente, existem poucos testes presumptivos binários amplamente utilizados disponíveis. Um teste presuntivo recentemente publicado utiliza espectroscopia de mobilidade iônica (IMS), que é um equipamento especializado que pode não estar disponível em muitos laboratórios6. Há também alguns testes de cor “Spot” que podem ser usados, embora eles normalmente são usados para determinação de distância ou para identificação de GSR em buracos de bala e feridas5. Adicionalmente, tem havido alguma atenção limitada na literatura para testes eletroquímicos para GSR que empregam a análise voltamétrica, que tem a vantagem de ser potencialmente portátil de campo, ou voltametria de decapagem anódica, que é extremamente método sensível para elementos metálicos7. Há muito pouca menção na literatura de biossensores projetados especificamente para a finalidade de detectar GSR, embora alguns biossensores para outras aplicações forenses foram publicados8.
Os elementos biológicos para cada dispositivo no sistema MicRoboCop e a construção do plasmídeo são ilustrados na Figura 1. A seta curvada na Figura 1b representa a região promotora que é ativada na presença do analyte, o oval é o local de ligação ribossomal que permite a tradução da proteína do repórter, a caixa cinzenta rotulada RFP é o gene que expressa vermelho proteína fluorescente, e o octagon vermelho é o local da terminação da transcrição. Todos os três dispositivos serão usados juntos como um sistema para detectar GSR. Cada dispositivo com um promotor específico (SbRFP, PbRFP e TNT-RFP) será incubado com a amostra que está sendo testada e a fluorescência da RFP será medida. RFP só será expressado se o analisador químico apropriado está presente e ativa a região promotora. Três dispositivos que respondem a algumas das substâncias químicas presentes no GSR foram projetados e são apresentados neste trabalho.
Os promotores utilizados nos três dispositivos microbocop são um promotor sensível ao arsênico e antimônio, sbrfp9,10, um promotor sensível à chumbo, pbrfp11,12 e um promotor sensível TNT, TNT-RFP 13. porque uma busca na literatura não revelou nenhum promotor projetado responder ao bário, o promotor de TNT foi selecionado preferivelmente desde que este promotor é sensível a um número de compostos estruturalmente relacionados (em particular, 2,4-dinitrotoluene e dinitrobenzeno) que são conhecidos por ser uma parte dos compostos orgânicos deixados para trás em GSR. Este promotor foi usado com sucesso para detectar especificamente quantidades minuciosa de TNT e 2,4-dinitrotolueno (2,4-DNT) em minas terrestres enterradas13. Usando os três dispositivos juntos como um sistema, um teste positivo para GSR produzirá fluorescência em todos os três dispositivos. Um sinal de fluorescência em apenas um ou dois dispositivos indicará outra fonte ambiental da (s) analito ou no caso do promotor TNT, ativação por um composto que não é um composto orgânico deixado para trás em GSR. Ao utilizar todos os três dispositivos em conjunto, a possibilidade de resultados falsos positivos devido a fontes ambientais é minimizada. Munição sem chumbo, que está ganhando popularidade, ainda representa apenas cerca de 5% das vendas de munição nos Estados Unidos; daqui, os resultados falsos negativos devido à ausência de chumbo podem ser uma possibilidade mas há ainda uma utilidade em um sensor que use a ligação como um marcador para o GSR14. Além desta aplicação forense específica, cada dispositivo pode ser usado separadamente para fins de detecção de contaminantes ambientais.
Os protocolos apresentados incluem as técnicas de biologia sintética utilizadas para criar os dispositivos (bactérias do sensor) e as técnicas analíticas para verificar a função dos dispositivos e analisar os sinais de fluorescência obtidos. O protocolo também inclui a coleta de evidências forenses na forma de mão limpando para coletar GSR das mãos de um suspeito ou limpando para coletar GSR de uma superfície. Os resultados do dispositivo do sensor da ligação são apresentados como resultados do exemplo, junto com uma demonstração de um teste positivo para o GSR usando uma carcaça gasta do cartucho.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modificações e resolução de problemas
O experimento descrito na tabela 4 pode ser modificado de qualquer forma adequada aos sensores que foram projetados. O aspecto mais importante de um sensor químico é avaliar sua sensibilidade e especificidade. É benéfico assegurar-se de que uma escala larga das concentrações do analito esteja analisada para determinar a escala analítica útil do sensor. Também vale a pena determinar um nível máximo de analito…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores desejam reconhecer os alunos da Universidade de Longwood em BIOL 324 (genética) e os alunos em CHEM 403 (Advanced Chemical laboratório resolução de problemas) que estiveram envolvidos na preparação inicial e testes dos biosensores de antimônio e chumbo. A idéia para MicRoboCop foi concebida no workshop GCAT SynBIO (verão 2014), que é financiado pela NSF e Howard Hughes Medical Institute e hospedado pela Universidade de Maryland Baltimore County. Os autores também reconhecem o financiamento recebido da escola de artes e Ciências Cook-Cole, da Universidade Longwood, e do GCAT SynBio Alumni Grant.
Materials
| 1,3-dinitrobenzene, 97% | Aldrich | D194255-25G | |
| 2,4-dinitrotoluene, 97% | Aldrich | 101397-5G | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-500 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Antimony, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified) | Fisher Scientific | SA450-100 | Standard in dilute HNO3 |
| Cut Smart Buffer | New England BioLabs | B7204S | |
| Duplex Buffer | Integrated DNA Technologies | 11-01-03-00 | |
| EcoRI-HF Restriction Enzyme | New England BioLabs | R3101S | |
| Ethanol, HPLC grade, denatured | Acros Organics | AC611050040 | Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work. |
| Eurofins Genomics SimpleSeq DNA Sequencing Kits | Eurofins Genomics | SimpleSeq Kit Standard | |
| Forward primer for colony PCR | Integrated DNA Technologies | 5’- GCCGCTTGAATTCGTCATATAT-3’ | |
| Forward primer for DNA sequencing | Integrated DNA Technologies | 5’- GTAAAACGACGGCCAGTG-3’ | |
| IBI Science High Speed Plasmid Mini-kit | IBI Scientific | IB47101 | |
| LB Broth, Miller | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
| Lead, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified) | Fisher Scientific | SL21-100 | Standard in dilute HNO3 |
| LeadOff Disposable Cleaning and Decon Wipes | Hygenall | 45NRCN | Sold in canisters or individually wrapped, any alcohol based wipe will work. |
| Methanol, HPLC grade | Fisher Scientific | A452-4 | Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work. |
| NEB 5-alpha Competent E. coli cells | New England BioLabs | C2987I | |
| NheI-HF Restriction Enzyme | New England BioLabs | R3131S | |
| Nuclease free water | New England BioLabs | B1500S | |
| OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer | New England BioLabs | M0482S | |
| Plasmids from the registry of standard biological parts used for synthetic biology | Registry of Standard Biological Parts | http://parts.igem.org/Main_Page | |
| Promoter Sequences | Integrated DNA Technologies | Sb promoter: 5’-GCATGAATTCAGTCAT ATATGTTTTTGACTTATCCGCTTCGAAGAGAG AGACACTACCTGCAACAATCGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCTCACTATATACAAAAACT GAATAGGCGAAGCTTCTCTCTCTGTGATGGAC GTTGTTAGCGATCGCGTA-5’ Pb promoter: 5’-GCATGAATTCGTCTTG ACTCTATAGTAACTAAGGGTGTATAATCGGCA ACGCGAGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCAGAACTGAGATATCATTG ATCTCCCACATCTTAGCCGTTGCGCTGCGATCGCGTA-5’ TNT promoter: 5’GCATTCTAGATCAATT TATTTGAACAAGGCGGTCAATTCTCTTCGATT TTATCTCTCGTAAAAAAACGTGATACTCATCA CATCGACGAAACAACGTCACTTATACAAAAAT CACCTGCGAGAGATTAATTGAATTCGCAT3’ 3’CGTAAGATCTAGTTAAATAAACTTGTTCCG CCAGTTAAGAGAAGCTAAAATAGAGAGCATTT TTTTGCACTATGAGTAGTGTAGCTGCTTTGTT GCAGTGAATATGTTTTTAGTGGACGCTCTCTA ATTAACTTAAGCGTA5’ |
|
| Reverse primer for colony PCR | Integrated DNA Technologies | 5’- GCCGCTTGAATTCGTCTAGACT- 3’ | |
| Reverse primer for DNA sequencing | Integrated DNA Technologies | 5’- GGAAACAGCTATGACCATG-3’ | |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S |
References
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