Preparación y aplicación de un nuevo biosensor bacteriano para la detección presuntiva de residuos de Disparos
Summary
Un protocolo se presenta utilizando técnicas de biología sintética para sintetizar un conjunto de biosensores bacterianos para el análisis de residuos de disparos, y para probar el funcionamiento de los dispositivos para su uso previsto utilizando espectroscopía de fluorescencia.
Abstract
MicRoboCop es un biosensor que ha sido diseñado para una aplicación única en la química forense. MicRoboCop es un sistema formado por tres dispositivos que, cuando se usan juntos, pueden indicar la presencia de residuos de disparos (GSR) produciendo una señal de fluorescencia en presencia de tres analitos clave (antimonio, plomo y componentes orgánicos de GSR). El protocolo describe la síntesis de los biosensores utilizando Escherichia coli (e. coli), y los métodos de química analítica utilizados para evaluar la selectividad y sensibilidad de los sensores. El funcionamiento del sistema se demuestra mediante el uso de GSR recogido desde el interior de una carcasa de cartucho gastado. Una vez preparados, los biosensores se pueden almacenar hasta que se necesiten y se pueden utilizar como prueba para estos analitos clave. Una respuesta positiva de los tres analitos proporciona una prueba positiva presuntiva para la GSR, mientras que cada dispositivo individual tiene aplicaciones para detectar los analitos en otras muestras (p. ej., un detector de contaminación por plomo en el agua potable). La principal limitación del sistema es el tiempo necesario para una señal positiva; trabajo futuro puede implicar el estudio de diferentes organismos para optimizar el tiempo de respuesta.
Introduction
Un biosensor es cualquier dispositivo analítico que utiliza componentes biológicos (como proteínas, ácidos nucleicos o organismos enteros) que producen una respuesta que se puede utilizar para la detección de una sustancia química o un analito. Como ejemplo, la industria minera de carbón utilizó un biosensor durante gran parte del siglo 20 para detectar la presencia de gases tóxicos de la mina: el canario en la mina de carbón1. Los mineros observaron la respuesta del organismo biológico (muerte o angustia) a un analito químico (monóxido de carbono) con el fin de proteger a los trabajadores. En un ejemplo más moderno y sofisticado, las bacterias se pueden alterar utilizando técnicas de biología sintética para responder a la presencia de un determinado analito químico mediante la exposición de una respuesta específica, como la expresión de una proteína fluorescente.
La biología sintética es un término amplio que se refiere a la construcción de dispositivos biológicos y sistemas que no existen de forma natural, o el re-diseño de los sistemas biológicos existentes para un propósito específico2. La biología sintética se distingue de la ingeniería genética por una metodología estándar y la existencia de piezas estandarizadas (elementos genéticos de biología sintética estándar) que se pueden utilizar para sintetizar dispositivos y sistemas. Una parte se introduce en el genoma de un dispositivo, un organismo como una bacteria, para expresar un cierto rasgo que servirá como una indicación de la función. Por ejemplo, en muchos dispositivos sintéticos, la expresión de una proteína fluorescente se introduce en un organismo unicelado como una proteína reportera. Se pueden combinar varios dispositivos en un sistema. Los genomas de microorganismos como las bacterias son fáciles de manipular de esta manera. Se han notificado numerosos ejemplos de biosensores específicos de una amplia gama de analitos químicos en la bibliografía de la última década3,4.
En este trabajo, el sistema MicRoboCop se presenta como un ejemplo de un biosensor diseñado utilizando técnicas de biología sintética con nuevas aplicaciones en la química forense y ambiental. MicRoboCop es un sistema de tres dispositivos separados que, cuando se combinan, permitirán a Escherichia coli expresar proteína fluorescente roja (RFP) en presencia de residuos de disparos (GSR) que se han recogido de las manos o de la superficie de una persona. Cada uno de los tres dispositivos responde a un analito químico específico que se sabe que es un componente de GSR5. Los tres analitos a los que responde el sistema son I. 2, 4, 6-trinitrotolueno (TNT) y compuestos relacionados, II. plomo (en forma de iones de plomo), y III. Antimonio (también en forma de iones).
GSR consiste en muchas sustancias químicas diferentes, pero los tres generalmente utilizados para identificar un residuo como GSR son bario, plomo, y antimonio5. La prueba probatoria estándar para la identificación de GSR es utilizar microscopía electrónica de barrido (SEM) con fluorescencia de rayos X de dispersión de energía (EDX)5. SEM-EDX permite a los analistas identificar la morfología única y los componentes elementales de GSR. En la actualidad, hay pocas pruebas presuntivas binarias ampliamente utilizadas disponibles. Una prueba presuntiva recientemente publicada utiliza espectroscopía de movilidad iónica (IMS), que es un equipo especializado que podría no estar disponible en muchos laboratorios6. También hay algunas pruebas de color “spot” que se pueden utilizar, aunque se utilizan típicamente para la determinación de la distancia o para la identificación GSR en los agujeros de la bala y las heridas5. Adicionalmente, ha habido cierta atención limitada en la literatura a las pruebas electroquímicas para GSR que emplean el análisis voltamométrico, que tiene la ventaja de ser potencialmente portable en el campo, o voltametría de desmonte anódico, que es un extremadamente método sensible para los elementos metálicos7. Hay muy poca mención en la literatura de biosensores diseñados específicamente con el propósito de detectar GSR, aunque algunos biosensores para otras aplicaciones forenses han sido publicados8.
Los elementos biológicos para cada dispositivo en el sistema MicRoboCop, y la construcción del plásmido, se ilustran en la figura 1. La flecha curvada en la figura 1B representa la región promotora que se activa en presencia del analito, el óvalo es el sitio de Unión ribosomal que permite la traducción de la proteína reportera, la caja gris ETIQUETADA como RFP es el gen que expresa el rojo proteína fluorescente, y el octágono rojo es el sitio de terminación de la transcripción. Los tres dispositivos se utilizarán juntos como un sistema para detectar GSR. Cada dispositivo con un promotor específico (SbRFP, PbRFP y TNT-RFP) será incubado con la muestra que se está probando y se medirá la fluorescencia de RFP. La RFP solo se expresará si el analito químico adecuado está presente y activa la región promotora. Tres dispositivos que responden a algunas de las sustancias químicas presentes en GSR han sido diseñados y se presentan en este trabajo.
Los promotores utilizados en los tres dispositivos de microbocop son un promotor sensible al arsénico y antimonio, sbrfp9,10, un promotor sensible al plomo, pbrfp11,12 y un promotor sensible de TNT, TNT-RFP 13. debido a que una búsqueda en la literatura no reveló ningún promotor diseñado para responder a Barium, el promotor de TNT fue seleccionado en su lugar ya que este promotor es sensible a una serie de compuestos estructuralmente relacionados (en particular, 2, 4-dinitrotolueno y dinitrobenceno) que son conocidos por ser una parte de los compuestos orgánicos dejados atrás en GSR. Este promotor se ha utilizado con éxito para detectar específicamente cantidades minutas de TNT y 2, 4-dinitrotolueno (2, 4-DNT) en las minas terrestres enterradas13. Utilizando los tres dispositivos juntos como un sistema, una prueba positiva para GSR producirá fluorescencia en los tres dispositivos. Una señal de fluorescencia en sólo uno o dos dispositivos indicará otra fuente ambiental del analito (s) o en el caso del promotor de TNT, activación por un compuesto que no es un compuesto orgánico dejado atrás en GSR. Mediante el uso de los tres dispositivos juntos, se minimiza la posibilidad de resultados falsos positivos debido a las fuentes ambientales. La munición sin plomo, que está ganando popularidad, todavía representa sólo el 5% de las ventas de municiones en los Estados Unidos; por lo tanto, los resultados falsos negativos debido a la ausencia de plomo pueden ser una posibilidad, pero todavía hay utilidad en un sensor que utiliza plomo como marcador para GSR14. Además de esta aplicación forense específica, cada dispositivo se puede utilizar por separado con el fin de detectar contaminantes ambientales.
Los protocolos presentados incluyen las técnicas de biología sintética utilizadas para crear los dispositivos (bacterias del sensor) y las técnicas analíticas para comprobar la función de los dispositivos y analizar las señales de fluorescencia obtenidas. El protocolo también incluye la recolección de evidencia forense en forma de limpieza de manos para recoger GSR de las agujas de un sospechoso o hisopado para recoger GSR de una superficie. Los resultados del dispositivo del sensor de plomo se presentan como resultados de ejemplo, junto con una demostración de una prueba positiva para GSR utilizando una carcasa de cartucho gastado.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las modificaciones y la solución de problemas
El experimento descrito en el cuadro 4 se puede modificar de cualquier manera adecuado a los sensores que se han diseñado. El aspecto más importante de un sensor químico es evaluar su sensibilidad y especificidad. Es beneficioso asegurarse de que se analice una amplia gama de concentraciones del analito para determinar el rango analítico útil del sensor. También vale la pena determinar un nivel máximo de an…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean reconocer a los estudiantes de la Universidad de Longwood en BIOL 324 (genética) y los estudiantes en CHEM 403 (solución avanzada de problemas de laboratorio químico) que estuvieron involucrados en la preparación inicial y pruebas de los biosensores de antimonio y plomo. La idea para MicRoboCop fue concebida en el taller GCAT SynBIO (verano 2014), financiado por NSF y el Howard Hughes Medical Institute y organizado por la Universidad de Maryland, Condado de Baltimore. Los autores también reconocen la financiación recibida de la escuela de Artes y Ciencias Cook-Cole de la Universidad de Longwood y la beca GCAT SynBio Alumni.
Materials
| 1,3-dinitrobenzene, 97% | Aldrich | D194255-25G | |
| 2,4-dinitrotoluene, 97% | Aldrich | 101397-5G | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-500 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Antimony, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified) | Fisher Scientific | SA450-100 | Standard in dilute HNO3 |
| Cut Smart Buffer | New England BioLabs | B7204S | |
| Duplex Buffer | Integrated DNA Technologies | 11-01-03-00 | |
| EcoRI-HF Restriction Enzyme | New England BioLabs | R3101S | |
| Ethanol, HPLC grade, denatured | Acros Organics | AC611050040 | Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work. |
| Eurofins Genomics SimpleSeq DNA Sequencing Kits | Eurofins Genomics | SimpleSeq Kit Standard | |
| Forward primer for colony PCR | Integrated DNA Technologies | 5’- GCCGCTTGAATTCGTCATATAT-3’ | |
| Forward primer for DNA sequencing | Integrated DNA Technologies | 5’- GTAAAACGACGGCCAGTG-3’ | |
| IBI Science High Speed Plasmid Mini-kit | IBI Scientific | IB47101 | |
| LB Broth, Miller | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
| Lead, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified) | Fisher Scientific | SL21-100 | Standard in dilute HNO3 |
| LeadOff Disposable Cleaning and Decon Wipes | Hygenall | 45NRCN | Sold in canisters or individually wrapped, any alcohol based wipe will work. |
| Methanol, HPLC grade | Fisher Scientific | A452-4 | Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work. |
| NEB 5-alpha Competent E. coli cells | New England BioLabs | C2987I | |
| NheI-HF Restriction Enzyme | New England BioLabs | R3131S | |
| Nuclease free water | New England BioLabs | B1500S | |
| OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer | New England BioLabs | M0482S | |
| Plasmids from the registry of standard biological parts used for synthetic biology | Registry of Standard Biological Parts | http://parts.igem.org/Main_Page | |
| Promoter Sequences | Integrated DNA Technologies | Sb promoter: 5’-GCATGAATTCAGTCAT ATATGTTTTTGACTTATCCGCTTCGAAGAGAG AGACACTACCTGCAACAATCGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCTCACTATATACAAAAACT GAATAGGCGAAGCTTCTCTCTCTGTGATGGAC GTTGTTAGCGATCGCGTA-5’ Pb promoter: 5’-GCATGAATTCGTCTTG ACTCTATAGTAACTAAGGGTGTATAATCGGCA ACGCGAGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCAGAACTGAGATATCATTG ATCTCCCACATCTTAGCCGTTGCGCTGCGATCGCGTA-5’ TNT promoter: 5’GCATTCTAGATCAATT TATTTGAACAAGGCGGTCAATTCTCTTCGATT TTATCTCTCGTAAAAAAACGTGATACTCATCA CATCGACGAAACAACGTCACTTATACAAAAAT CACCTGCGAGAGATTAATTGAATTCGCAT3’ 3’CGTAAGATCTAGTTAAATAAACTTGTTCCG CCAGTTAAGAGAAGCTAAAATAGAGAGCATTT TTTTGCACTATGAGTAGTGTAGCTGCTTTGTT GCAGTGAATATGTTTTTAGTGGACGCTCTCTA ATTAACTTAAGCGTA5’ |
|
| Reverse primer for colony PCR | Integrated DNA Technologies | 5’- GCCGCTTGAATTCGTCTAGACT- 3’ | |
| Reverse primer for DNA sequencing | Integrated DNA Technologies | 5’- GGAAACAGCTATGACCATG-3’ | |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S |
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