Inattivazione chimica dell'E3 Ubiquitin Ligase Cereblon da parte di Homo-PROTAC con sede a Pomeredomide
Summary
Questo lavoro descrive la sintesi e la caratterizzazione di un omo-PROTAC bimalidomide a base di pomalimmide come un nuovo approccio per indurre l’ubiquitinazione e la degradazione della cereblon della ligase dell’ubiquitina E3 (CRBN), l’obiettivo degli analoghi di talidomide.
Abstract
I farmaci immunomodulatori (IMid) e i suoi analoghi, lenalidomide e pomalidomide, tutti i farmaci approvati dalla FDA per il trattamento del mieloma multiplo, inducono l’ubiquitazione e la degradazione dei fattori di trascrizione linfoide Ikaros (IK-F1) e Aiolos (IK-F3) tramite il cereblon (CRBN) E3 ubiquitina ligase per degradazione proteasomica. Gli IMID sono stati recentemente utilizzati per la generazione di chimere di proteolisi bifunzionale targeting (PROTAC) per indirizzare altre proteine per l’ubiquitinazione e la degradazione proteasomica da parte della ligase CRBN E3. Abbiamo progettato e sintetizzato proTAC omobifunzionali basati su pomalidomide e analizzato la loro capacità di indurre l’ubiquitinazione e la degradazione di CRBN. Qui, CRBN serve come entrambi, l’E3 ubiquitin ligase e l’obiettivo allo stesso tempo. Il composto omo-PROTAC 8 degrada il CRBN con un’alta potenza con solo effetti residui minimi su IK-F1 e IK-F3. L’inattivazione di CRBN da parte del composto 8 non ha avuto alcun effetto sulla vitalità cellulare e sulla proliferazione di diverse linee cellulari multiple del mieloma. Questo omo-PROTAC abroga gli effetti degli IMID in più cellule del mieloma. Pertanto, i nostri composti omodimeri a base di pomalidomide possono aiutare a identificare i substrati endogeni e le funzioni fisiologiche del CRBN e a studiare il meccanismo molecolare degli IMID.
Introduction
I farmaci immunomodulatori (IMid) e i suoi analoghi, lenalidomide e pomalidomide, tutti approvati per il trattamento del mieloma multiplo, si legano alla sigillante ligase dell’ubiquitina E3 (CRBN), un adattatore substrato per l’ubiereanzi a 2la-RING E3 (CRL4CRBN)1,2,3. L’associazione degli IMiD aumenta l’affinità di CRL4CRBN ai fattori di trascrizione linfoidi Ikaros (IK-F1) e Aiolos (IK-F3), portando alla loro ubiquitazione e degradazione (Figura 1)4,5, 6 È possibile: , 7 (in questo stato , 8. Dal momento che iK-F1 e IK-F3 sono essenziali per le cellule multiple del mieloma, la loro inattivazione provoca inibizione della crescita. SALL4 è stato recentemente trovato come un ulteriore neo-substrato indotta da IMiD di CRBN che è probabilmente responsabile della teratogenicità e della cosiddetta catastrofe Contergan negli anni ’50 causata dalla talidomide9,10. Al contrario, la cassicina 1 è un substrato di CRBN specifico di lenalidomide che è implicato nell’effetto terapeutico nella sindrome della mielodiplastico con cromosoma 5q eliminazioni11.
La capacità delle piccole molecole di indirizzare una proteina specifica per la degradazione è un’implicazione interessante per lo sviluppo di farmaci moderni. Mentre il meccanismo della talidomide e dei suoi analoghi è stato scoperto dopo il loro primo utilizzo negli esseri umani, la cosiddetta Proteolisi Targeting Chimeras (PROTAC) sono stati progettati per indirizzare specificamente una proteina di interesse (POI) (Figura 2)12,13,14,15,16,17,18. I PROTAC sono molecole eterobifunzionali costituite da un ligando specifico per il POI collegato tramite un linker a un ligando di una ligase ubiquitina E3 come CRBN o von-Hippel-Lindau (VHL)18,19,20, 21,22. I PROCAC inducono la formazione di un complesso ternario transitorio, dirigendo il POI alla ligase dell’ubiquitina E3, con conseguente ubiquitinazione e degradazione proteasomica. I principali vantaggi dei PROTAC rispetto agli inibitori convenzionali sono che il legame a un POI è sufficiente piuttosto che la sua inibizione e quindi i PROTAC possono potenzialmente indirizzare uno spettro molto più ampio di proteine, comprese quelle considerate infarmacibili come fattori di trascrizione15. Inoltre, le molecole chimetriche agiscono cataliticamente e quindi hanno un’alta potenza. Dopo il trasferimento dell’ubiquitina al POI, il complesso ternario si dissocia ed è disponibile per la formazione di nuovi complessi. Pertanto, concentrazioni molto basse di PROTAC sono sufficienti per la degradazione della proteina bersaglio23.
Qui descriviamo la sintesi di una pomalimide-pomalidomide coniugata homo-PROTAC (composto 8) che recluta CRBN per la degradazione di se stesso24. L’E3 ubiquitin ligase CRBN è sia il reclutatore che l’obiettivo contemporaneamente (Figura 3). Per convalidare i dati, abbiamo anche sintetizzato un controllo di rilegatura negativo (composto 9). I nostri dati confermano che l’omo-PROTAC appena sintetizzato è specifico per la degradazione CRBN e ha solo effetti minimi su altre proteine.
Protocol
Representative Results
Discussion
La progettazione di tali omo-PROTAC come descritto qui per CRBN si basa sulla specifica affinità della pomalimofilia con CRBN, che è stata utilizzata con successo in numerosi PROTAC eterobifunzionali e ha portato allo sviluppo di PROTAC 8 come degrado CRBN selettivo. La specificità della nostra molecola è già stata confermata dalle analisi proteomiche24. Per knockout geneticamente mediato, l’esclusione e la convalida degli effetti collaterali è impegnativo e richiede tempo. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (Programma Emmy-Noether Kr-3886/2-1 e SFB-1074 a J.K.; DA FOR2372 a M.G.)
Materials
| 1,1'-Carbonyldiimidazole | TCI chemicals | C0119 | |
| 2,2′-(Ethylenedioxy)-bis(ethylamine) | Sigma-Aldrich | 385506 | Compound 6 |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 3-Fluorophthalic anhydride, 98 % | Alfa Aesar | A12275 | |
| 4-Dimethylaminopyridine, 99 % | Acros | 148270250 | Toxic |
| Acrylamidstammlösung/ Bisacrylamid (30%/0,8%) | Carl Roth | 3029.1 | |
| Aiolos (D1C1E) mAB | Cell signaling | 15103S | |
| Anti-CRBN antibody produced in rabbit | Sigma | HPA045910 | |
| Anti-rabbit IgG HRP-linked antibody | Sigma | 7074S | |
| Ammonium Persulfate | Roth | 9592.2 | |
| Boc-Gln-OH | TCI chemicals | B1649 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100G | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7571 | |
| ChemiDoc XRS+ | Bio-Rad | 1708265 | |
| DMF, anhydrous, 99.8 % | Acros | 348435000 | Extra Dry over Molecular Sieve |
| DMSO, anhydrous, 99.7 % | Acros | 348445000 | Extra Dry over Molecular Sieve |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 15523-1L-R | |
| Goat anti-mouse (HRP conjugated) | Santa Cruz biotechnology | sc-2005 | |
| Halt Protease & Phosphatase Inhibitor Single-use Cocktail (100X) | Thermo Scientific | 1861280 | |
| Ikaros (D6N9Y) Mab | Cell signaling | 14859S | |
| ImmobilonP Transfer Membrane (0,45µm) | Merck | IPVH000010 | |
| Iodomethane, 99 % | Sigma-Aldrich | I8507 | Highly toxic |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 32213-2.5L | |
| Mg132 | Selleckchem | S2619 | |
| Mini Trans-Blot electrophoretic transfer cell | Bio-Rad | 1703930 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 1658004 | |
| MLN4942 | biomol (cayman) | Cay15217-1 | |
| Monoclonal Anti-α-Tubulin antibody produced in mouse (B512) | Sigma | T5168 | |
| N-Ethyldiisopropylamine, 99 % | Alfa Aesar | A11801 | |
| Nonfat dried milk powder | PanReac AppliChem | A0830,0500 | |
| Nunc F96 MicroWell White Polystyrene Plate | Thermo Scientific | 136101 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Thermo Scientific | NP0008 | |
| Pierce BCA Protein Assay kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Pomalidomide | Selleckchem | S1567 | |
| RestoreTM Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientific | 46430 | |
| sodium dodecyl sulfate | Carl Roth | 183.1 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | A9539-500g | |
| TEMED | Carl Roth | 2367.3 | |
| tert-Butyl N-[2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl]carbamate | Sigma-Aldrich | 89761 | Compound 5 |
| Tricin | Carl Roth | 6977.4 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503-1kg | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ml | |
| WesternBright ECL spray | Advansta | K-12049-D50 |
References
- Ito, T., et al. Identification of a primary target of thalidomide teratogenicity. Science. 327 (5971), 1345-1350 (2010).
- Lopez-Girona, A., et al. Cereblon is a direct protein target for immunomodulatory and antiproliferative activities of lenalidomide and pomalidomide. Leukemia. 26 (11), 2326-2335 (2012).
- Fischer, E. S., et al. Structure of the DDB1-CRBN E3 ubiquitin ligase in complex with thalidomide. Nature. 512 (7512), 49-53 (2014).
- Gandhi, A. K., et al. Immunomodulatory agents lenalidomide and pomalidomide co-stimulate T cells by inducing degradation of T cell repressors Ikaros and Aiolos via modulation of the E3 ubiquitin ligase complex CRL4(CRBN). British Journal of Haematology. 164 (6), 811-821 (2014).
- Kronke, J., Hurst, S. N., Ebert, B. L. Lenalidomide induces degradation of IKZF1 and IKZF3. Oncoimmunology. 3 (7), e941742 (2014).
- Lu, G., et al. The myeloma drug lenalidomide promotes the cereblon-dependent destruction of Ikaros proteins. Science. 343 (6168), 305-309 (2014).
- Zhu, Y. X., Kortuem, K. M., Stewart, A. K. Molecular mechanism of action of immune-modulatory drugs thalidomide, lenalidomide and pomalidomide in multiple myeloma. Leukemia & Lymphona. 54 (4), 683-687 (2013).
- Chamberlain, P. P., et al. Structure of the human Cereblon-DDB1-lenalidomide complex reveals basis for responsiveness to thalidomide analogs. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (9), 803-809 (2014).
- Donovan, K. A., et al. Thalidomide promotes degradation of SALL4, a transcription factor implicated in Duane Radial Ray syndrome. eLife. 7, (2018).
- Matyskiela, M. E., et al. SALL4 mediates teratogenicity as a thalidomide-dependent cereblon substrate. Nature Chemical Biology. 14 (10), 981-987 (2018).
- Kronke, J., et al. Lenalidomide induces ubiquitination and degradation of CK1alpha in del(5q) MDS. Nature. 523 (7559), 183-188 (2015).
- Sakamoto, K. M., et al. Protacs: chimeric molecules that target proteins to the Skp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (15), 8554-8559 (2001).
- Sakamoto, K. M., et al. Development of Protacs to target cancer-promoting proteins for ubiquitination and degradation. Molecular & Cellular Proteomics. 2 (12), 1350-1358 (2003).
- Schneekloth, J. S., et al. Chemical genetic control of protein levels: selective in vivo targeted degradation. Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3748-3754 (2004).
- Gu, S., Cui, D., Chen, X., Xiong, X., Zhao, Y. PROTACs: An Emerging Targeting Technique for Protein Degradation in Drug Discovery. Bioessays. 40 (4), e1700247 (2018).
- Collins, I., Wang, H., Caldwell, J. J., Chopra, R. Chemical approaches to targeted protein degradation through modulation of the ubiquitin-proteasome pathway. Biochemical Journal. 474 (7), 1127-1147 (2017).
- Neklesa, T. K., Winkler, J. D., Crews, C. M. Targeted protein degradation by PROTACs. Pharmacology & Therapeutics. 174, 138-144 (2017).
- Winter, G. E., et al. Phthalimide conjugation as a strategy for in vivo target protein degradation. Science. 348 (6241), 1376-1381 (2015).
- Maniaci, C., et al. Homo-PROTACs: bivalent small-molecule dimerizers of the VHL E3 ubiquitin ligase to induce self-degradation. Nature Communications. 8 (1), 830 (2017).
- Crew, A. P., et al. Identification and Characterization of Von Hippel-Lindau-Recruiting Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of TANK-Binding Kinase 1. Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).
- Lu, J., et al. Hijacking the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon to Efficiently Target BRD4. Chemistry & Biology. 22 (6), 755-763 (2015).
- Steinebach, C., et al. PROTAC-mediated crosstalk between E3 ligases. Chemical Communications. 55 (12), 1821-1824 (2019).
- Tinworth, C. P., Lithgow, H., Churcher, I. Small molecule-mediated protein knockdown as a new approach to drug discovery. Medchemcomm. 7 (12), 2206-2216 (2016).
- Steinebach, C., et al. Homo-PROTACs for the Chemical Knockdown of Cereblon. ACS Chemical Biology. 13 (9), 2771-2782 (2018).
- Ambrozak, A., et al. Synthesis and Antiangiogenic Properties of Tetrafluorophthalimido and Tetrafluorobenzamido Barbituric Acids. ChemMedChem. 11 (23), 2621-2629 (2016).
- Zhou, B., et al. Discovery of a Small-Molecule Degrader of Bromodomain and Extra-Terminal (BET) Proteins with Picomolar Cellular Potencies and Capable of Achieving Tumor Regression. Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).
- Zhang, C., et al. Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK). European Journal of Medicinal Chemistry. 151, 304-314 (2018).
- Runcie, A. C., Chan, K. H., Zengerle, M., Ciulli, A. Chemical genetics approaches for selective intervention in epigenetics. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 186-194 (2016).
- Kronke, J., et al. Lenalidomide causes selective degradation of IKZF1 and IKZF3 in multiple myeloma cells. Science. 343 (6168), 301-305 (2014).
- Eichner, R., et al. Immunomodulatory drugs disrupt the cereblon-CD147-MCT1 axis to exert antitumor activity and teratogenicity. Nature Medicine. 22 (7), 735-743 (2016).
- Zhu, Y. X., et al. Cereblon expression is required for the antimyeloma activity of lenalidomide and pomalidomide. Blood. 118 (18), 4771-4779 (2011).
- Kortum, K. M., et al. Targeted sequencing of refractory myeloma reveals a high incidence of mutations in CRBN and Ras pathway genes. Blood. 128 (9), 1226-1233 (2016).
- Gil, M., et al. Cereblon deficiency confers resistance against polymicrobial sepsis by the activation of AMP activated protein kinase and heme-oxygenase-1. Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 976-981 (2018).
- Kim, H. K., et al. Cereblon in health and disease. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 468 (8), 1299-1309 (2016).
- Lee, K. M., et al. Disruption of the cereblon gene enhances hepatic AMPK activity and prevents high-fat diet-induced obesity and insulin resistance in mice. Diabetes. 62 (6), 1855-1864 (2013).
