Høyoppløselig bilde av Nuclear Dynamics i levende celler under Uniaxial strekk belastning
Summary
Ved hjelp av en tidligere konstruert enhet for å bruke mekanisk belastning på tilhenger celler, beskriver dette papiret en redesignet undergrunnen geometri og et tilpasset apparat for høyoppløselig enkelt celle bilde av anstrengte celler med en 100-og olje nedsenking objektiv.
Abstract
Ekstracellulære mekaniske belastninger er kjent for å lokke fram celle fenotypiske svar og har fysiologisk relevans i flere vev systemer. For å fange effekten av anvendt ekstracellulære strekk belastning på celle populasjoner i vitro via biokjemiske analyser, en enhet har tidligere blitt utformet som kan fabrikkert enkelt og er liten nok til å passe inn i vev kultur inkubatorer, så vel som på toppen av mikroskop etappene. Den tidligere utformingen av Polydimethylsiloxan-undergrunnen tillot imidlertid ikke høyoppløsnings subcellulære avbildning via olje-nedsenking mål. Dette arbeidet beskriver en redesignet geometri av Polydimethylsiloxan undergrunnen og en tilpasset Imaging oppsett som sammen kan forenkle høyoppløselig subcellulære avbildning av levende celler under anvendt belastning. Denne undergrunnen kan brukes med den samme, tidligere utformede enheten, og har derfor de samme fordelene som nevnt ovenfor, i tillegg til å tillate optisk bildebehandling med høy oppløsning. Utformingen av Polydimethylsiloxan undergrunnen kan forbedres ved å innlemme et rutenett som vil lette å spore den samme cellen før og etter påføring av belastningen. Representative resultater demonstrere høyoppløselig time-lapse Imaging av fluorescensmerkete merket kjerner innenfor anstrengt celler tatt ved hjelp av metoden beskrevet her. Disse kjernefysiske dynamikk data gir innsikt i mekanismen som brukes strekk belastning fremmer differensiering av oligodendrocyte stamceller.
Introduction
Celler og vev i kroppen er utsatt for ulike mekaniske signaler, inkludert strekk stammer. Men effekten av disse signalene på biologi av nevrale celler ennå ikke er studert grundig og forstått fullt. I det sentrale nervesystemet er kilder til mekanisk belastning inkludert utviklings vekst1,2,3,4, fysiologiske prosesser som for eksempel ryggmargen bøying, blod og spinalvæske pulsering, og patologiske tilstander som traumer, axon hevelse, gliacellene arrdannelse, eller tumor vekst5,6,7,8. Det er verdt å undersøke hvordan strekk belastningen påvirker differensiering av oligodendrocytes og den påfølgende myelination av axons, som er en kritisk prosess i virveldyr sentralnervesystemet. Ved hjelp av en spesialdesignet strekk enhet og elastomer multiwell plater, tidligere arbeider9,10 har vist at statisk uniaxial belastning kan øke oligodendrocyte differensiering via globale endringer i genuttrykk 10. for å få ytterligere forståelse av mekanismene for strekk mechanotransduction i disse cellene, må det tidligere eksperimentelle apparatet være redesignet som beskrevet her, for å muliggjøre høyoppløselig fluorescens avbildning av kjernefysisk dynamikk i levende celler under belastning. Nærmere bestemt, en enkelt-brønn Polydimethylsiloxan plate er utviklet, og Imaging konfigurasjonen er redesignet for å tillate tid-lapse Imaging av levende celler under belastning ved hjelp av en 100% olje nedsenking linse. For å eliminere de negative optiske effektene av Polydimethylsiloxan i lys veien, blir cellene avbildet ikke gjennom Polydimethylsiloxan platen, men i den omvendte posisjonen, gjennom dekkglasset som dekker celle rommet. Ved hjelp av denne nye Imaging design, hundrevis av høy oppløsning time-lapse filmer er registrert, av individuelle cellekjerner innenfor intakt tilhenger celler, der kromatin er merket med merking histone H2B til grønt fluorescerende protein. Disse filmene viser at strekk belastningen induserer endringer i kromatin struktur og dynamikk som er i samsvar med progresjon av oligodendrocyte differensiering.
Live celle avbildning under anvendt belastning er teknisk utfordrende og krever en enhetsutforming som er kompatibel med mikroskop systemet. Den tilpassede designen er beskrevet her presenterer et billig alternativ til kommersielle løsninger. Dens dimensjoner aktivere sin installasjon på mikroskop stadier og live celle Imaging ved høy romlig oppløsning under anvendt belastning. Bildebehandlings oppsettet er utformet for å muliggjøre levende celle bilde ved hjelp av en 100% olje nedsenking linse med den høyeste klarhet, gjennom dekselet glass, ikke gjennom laget av Polydimethylsiloxan plate som ellers reduserer bildekvaliteten og er vanlig i de fleste Bildeoppsett under belastning. Enheten, med en montert plate som inneholder celler, kan også lagres lett i inkubator. Denne enheten er utformet for å påføre uniaxial belastning på substrata som letter tilhenger cellekultur og opprettholder en stabil og ensartet belastning over flere dager. Oppsettet som er beskrevet her kan brukes for høyoppløselig bildebehandling av ulike tilhenger celletyper under belastning, noe som gjør det aktuelt å mechanotransduction studier i mange felt av celle mechanobiology.
Protocol
Representative Results
Discussion
En enhet har tidligere1 blitt designet for anvendelse av ekstracellulære strekk belastning på tilhenger celler. Utformingen av Polydimethylsiloxan undergrunnen i dette arbeidet var tilstrekkelig for biokjemiske analyser, samt lav oppløsning Imaging av strukket celler. I dette arbeidet, undergrunnen ble redesignet, og en roman Imaging konfigurasjon som forenkler høyoppløselig subcellulære Live celle Imaging ble innført. Fordelene med dette systemet er mange: det kan bygges i laboratoriet ved…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Alle forfatterne takknemlig erkjenner finansiering støtte fra National Research Foundation i Singapore gjennom Singapore-MIT Alliance for forskning og teknologi (SMART) BioSystems og Mikromekanikk (BioSyM) tverrfaglig forskergruppe. Forfattere Dr. Jagielska og Dr. Van Vliet også takknemlig erkjenner finansiering og støtte fra saks-Kavanaugh Foundation. Forfatterne takker William Ong og Dr. Sing Yian chew fra Nanyang Technological University, Singapore, for å gi rotte oligodendrocyte stamceller for noen eksperimenter beskrevet i dette arbeidet, og forfatterne takker Dr. G. V. Shivashankar fra Mechanobiology Institute, University of Singapore, Singapore, for diskusjon om kjernefysiske område svingninger.
Materials
| Primary cells | Primary Oligodendrocyte Progenitor Cells isolated from Neonatal Rats were provided by Dr. S. Y. Chew's lab at Nanyang Technological University |
||
| Media | |||
| DMEM high glucose | Gibco | 11996-065-500ml | |
| Pen/Strep | Gibco | 15070-063-100ml | |
| FGF | Prospec | CYT-608-50ug | |
| PDGF | Prospec | CYT-776-10ug | |
| Media Stock components | |||
| BSA | Sigma | A9418-10G | |
| Progesterone | Sigma | P8783-1G | |
| Putrescine | Sigma | P5780-5G | |
| Sodium Selenite | Sigma | S5261-10G | |
| Tri-iodothyronine | Sigma | T6397-100MG | |
| Thyroxine | Sigma | T1775-100MG | |
| Holo-Transferrin | Sigma | T0665-500MG | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Mold and PDMS plate | |||
| PDMS – Dow Corning Sylgard 184 | Ellsworth | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Mold – Liquid Plastic | Smooth-On | Smooth Cast 310 – Trail Size | |
| Substrate Coatings | |||
| poly-D-lysine | Sigma | P6407-5MG | |
| Fibronectin | Sigma | F1141-2MG | |
| Histone staining | |||
| CellLigt H2B-GFP BacMam | Molecular Probes | C10594 | |
| Surface functionalization | |||
| APTES | Sigma | A3648-100ml | |
| BS3 | Covachem | 13306-100mg | |
| HEPES buffer pH 8.0 | Alfa Aesar | J63578-AK-250ml | |
| Cell detachment | |||
| Accutase | Invitrogen | A1110501-100ml |
References
- Bray, D. Mechanical tension produced by nerve cells in tissue culture. Journal of Cell Science. 410, 391-410 (1979).
- Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. 발생학. 389, (1983).
- Van Essen, D. C. A tension-based theory of morphogenesis and compact wiring in the central nervous system. Nature. , (1997).
- Smith, D. H. Stretch growth of integrated axon tracts: Extremes and exploitations. Progress in Neurobiology. 89, 231-239 (2011).
- Cullen, D. K., Simon, C. M., LaPlaca, C. M. Strain rate-dependent induction of reactive astrogliosis and cell death in three-dimensional neuronal-astrocytic co-cultures. Brain Research. , 103-115 (2011).
- Fisher, E., et al. Imaging correlates of axonal swelling in chronic multiple sclerosis brains. Annals of Neurology. 2, 219-228 (2007).
- Nikić, I., et al. A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Nature Medicine. 17, 495-500 (2011).
- Payne, S. C., Bartlett, C. A., Harvey, A. R., Dunlop, S. A., Fitzgerald, M. Functional loss during chronic secondary degeneration in rat optic nerve. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53, (2018).
- Zeiger, A. S., et al. Static mechanical strain induces capillary endothelial cell cycle re-entry and sprouting. Physical Biology. 13, 1-16 (2017).
- Jagielska, A., et al. Mechanical strain promotes oligodendrocyte differentiation by global changes of gene expression. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 93 (2017).
- Pajerowski, J. D., Dahl, K. N., Zhong, F. L., Sammak, P. J., Discher, D. E. Physical plasticity of the nucleus in stem cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1, 0 (2007).
- Talwar, S., Kumar, A., Rao, M., Menon, G. I., Shivashankar, G. V. Correlated spatio-temporal fluctuations in chromatin compaction states characterize stem cells. Biophysical Journal. 104, 553-564 (2013).
- Makhija, E., et al. Mechanical strain alters cellular and nuclear dynamics at early stages of oligodendrocyte differentiation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 59 (2018).
