D’imagerie intégrine Tension et Force cellulaire à résolution submicronique avec un capteur de Tension intégrative
Summary
Intégrine tension joue un rôle important dans diverses fonctions cellulaires. Avec un capteur de tension intégrative, tension intégrine est calibrée avec une sensibilité de picoNewton (pN) et image à résolution submicronique.
Abstract
Moléculaire tension transmise par obligations intégrine-ligand est le signal mécanique fondamental dans la voie de l’intégrine qui joue un rôle important dans de nombreuses fonctions cellulaires et les comportements. Pour calibrer et image intégrine tension avec force haute sensibilité et une résolution spatiale, nous avons développé un capteur de tension intégrative (STI), un capteur de tension fluorescent basées sur l’ADN. L’EVI est activé pour une fluorescence si maintient une tension moléculaire, convertissant ainsi la force de signal fluorescent au niveau moléculaire. Le seuil de tension pour l’activation de la STI est accordable dans la fourchette de 10 à 60 pN qui couvre bien la plage dynamique de l’intégrine tension dans les cellules. Sur un substrat greffé avec une ITS, la tension de l’intégrine des cellules adhérentes est visualisée par fluorescence et image à résolution submicronique. L’EVI est également compatible avec l’imagerie structurale cellulaire dans les cellules vivantes et les cellules fixes. La STI a été appliquée avec succès à l’étude de la contraction de plaquettes et la migration cellulaire. Cet article détaille la procédure pour la synthèse et l’application de la STI dans l’étude de force cellulaire intégrine-transmis.
Introduction
Cellules s’appuient sur les intégrines adhérer et d’exercer des forces cellulaires à la matrice extracellulaire. Transmission de force et adhérence cellulaire intégrine sont cruciales pour cellule diffusion1,2, migration3,4et survie5,6,7. À long terme, signalisation biomécaniques intégrine influe également sur cellule prolifération8,9,10 et différenciation11,12. Les chercheurs ont mis au point différentes méthodes pour mesurer et cellulaire de l’intégrine-transmis de carte oblige à l’interface de la cellule-matrice. Ces méthodes sont basées sur substrat élastique13, tableau de micropost14, ou atomique force microscopy (AFM)15,16. Méthodes élastiques de substrat et micropost reposent sur la déformation de substrats pour signaler le stress cellulaire et ont des limites en termes de résolution spatiale et forcer la sensibilité. AFM a force de haute sensibilité, mais il ne peut pas détecter la force à plusieurs endroits en même temps, compliquant la carte cellulaire force transmises par les intégrines.
Ces dernières années, plusieurs techniques ont été développées pour étudier la force cellulaire au niveau moléculaire. Un ensemble de capteurs de tension moléculaires basés sur polyéthylène glycol17,18, araignée de soie peptide19et ADN20,21,22,,23 ont été développés pour visualiser et surveiller la tension transmise par les protéines moléculaires. Parmi ces techniques, l’ADN a été adopté comme le matériau de synthèse dans la tension jauge d’attache (TGT), un linker cassables qui module la limite supérieure de l’intégrine tensions dans des cellules vivantes22,24. Plus tard, technique de transfert de résonance ADN et fluorescence ont été combinés pour créer en épingle à cheveux capteurs basés sur l’ADN fluorescente tension tout d’abord par Chen groupe23 et groupe20 de Salaita. Le capteur de tension basées sur l’ADN en épingle à cheveux intégrine tension en temps réel des rapports et a été appliqué avec succès à l’étude d’une série de fonctions cellulaires21. Par la suite, laboratoire de Wang combiné un TGT avec la paire de fluorophore-extincteur à tension intégrine rapport. Ce capteur est appelé une ITS25,26. La STI sont basée sur l’ADN à double brin (dsDNA) et a une plage dynamique plus large (pN 10-60) pour l’étalonnage de l’intégrine tension. Contrairement aux capteurs de basées sur l’ADN de l’épingle à cheveux, la STI ne signalent pas de force cellulaire en temps réel mais enregistre tous les événements de l’intégrine historique comme l’empreinte de force cellulaire ; ce processus d’accumulation de signal améliore la sensibilité cellulaire force d’imagerie, rendant possible à force cellulaire de l’image, même avec un microscope à fluorescence bas de gamme. La synthèse des STI est relativement plus pratique, car elle est créée par l’hybridation des deux ADN simple brin (ssDNA).
L’EVI est un ADN double brin 18-base-jumelé, conjugué à la biotine, un fluorophore, un désactiveur (Black Hole Quencher 2 [BHQ2])27et un acide (RGD) peptide cyclique arginylglycylaspartic28 comme un ligand de peptide intégrine (Figure 1). Le brin inférieur est conjugué avec le fluorophore (Cy3 est utilisé dans ce manuscrit, tandis que d’autres colorants, par exemple, série Cy5 ou Alexa, ont également fait leurs preuves possible dans notre laboratoire) et la balise de biotine, avec laquelle l’EVI est immobilisé sur un substrat par liaison biotine-avidine. Le brin supérieur est conjugué avec le peptide RGD et l’extincteur de trou noir, qui assouvit Cy3 avec environ 98 % trempe efficacité26,27. Avec le protocole présenté dans cet article, la densité du revêtement de l’ITS sur un substrat est d’environ 1 100/µm2. Il s’agit de la densité qui que nous a été calibrés pour 18 bp biotinylé dsDNA enduit sur le substrat Neutravidine fonctionnalisés en suivant le même protocole29de revêtement. Lorsque les cellules adhèrent au substrat recouvert de l’EVI, intégrine lie l’ITS par RGD et transmet la tension à la STI. La STI a une tolérance de tension spécifique (Ttol) qui est définie comme le seuil de tension qui sépare mécaniquement l’ADN double brin de l’ITS au sein de 2 s22. SA rupture par l’intégrine tension mène à la séparation de l’extincteur de la teinture qui émet par la suite par fluorescence. Par conséquent, la tension de l’intégrine invisible est convertie en un signal de fluorescence et la force cellulaire peut être mappée par imagerie de fluorescence.
Pour illustrer l’application de la STI, nous utilisons des poissons keratocyte ici, un modèle de cellule largement utilisée pour cell migration étude30,31,32, cellules CHO-K1, une lignée cellulaire non motile couramment utilisés et fibroblastes 3 t 3 NIH. Coimaging des structures de tension et de la cellule intégrine est également effectué.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’EVI est un très accessible et pourtant une technique puissante pour cellulaire forcer en termes de synthèse et application. Avec tout le matériel prêt, le STI peuvent être synthétisé dans 1 jour. Au cours d’expériences, seulement trois étapes de revêtement de surface sont nécessaires avant la culture cellulaire. Récemment, nous avons simplifié davantage la procédure de revêtement à une seule étape en reliant directement l’ITS à l’albumine sérique bovine, qui permet l’adsorption physique dir…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le fonds de démarrage fourni par l’Iowa State University et par le National Institute of General Medical Sciences (R35GM128747).
Materials
| BSA-biotin | Sigma-Aldrich | A8549 | |
| Neutravidin | Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
| Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | 434301 | |
| upper strand DNA | Integrated DNA Technologies | N/A | Customer designed. DNA sequence is shown in PROTOCOL section |
| lower strand DNA | Integrated DNA Technologies | N/A | Customer designed. DNA sequences are shown in PROTOCOL section. |
| sulfo-SMCC | Thermo Fisher Scientific | A39268 | |
| Cyclic peptide RGD with an amine group | Peptides International | PCI-3696-PI | |
| IMDM | ATCC | 62996227 | |
| FBS | ATCC | 302020 | |
| Penicillin | gibco | 15140122 | |
| TCEP | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| 200 uL petri dish | Cellvis | D29-14-1.5-N | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | N/A | spectrometer |
| SE410 Tall Air-Cooled Vertical Protein Electrophoresis Unit | Hoefer | SE410-15-1.5 | Device for electroporesis |
| CHO-K1 cell line | ATCC | CCL-61 | |
| NIH/3T3 cell line | ATCC | CRL-1658 | |
| Anti-Vinculin Antibody | EMD Millipore | 90227 | Primary antibody for vinculin immunostaining |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Superclonal Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A28175 | Secondary antibody for vinculin immunostaining |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Invitrogen | A22287 | |
| Eclipse Ti | Nikon | N/A | microscope |
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