Imaging Integrin spændinger og cellulære kraft på Submicron opløsning med en integrativ spænding Sensor
Summary
Integrin spænding spiller vigtige roller i forskellige cellefunktioner. Med en integrativ spænding sensor, er integrin spændinger kalibreret med picoNewton (pN) følsomhed og afbildet på submicron beslutning.
Abstract
Molekylær spænding fremsendes integrin-ligand obligationer er grundlæggende mekaniske signalet i integrin pathway, som spiller vigtige roller i mange cellefunktioner og adfærd. For at kalibrere og billed integrin spændinger med høj kraft følsomhed og rumlige opløsning, udviklede vi en integrativ spænding sensor (ITS), en DNA-baseret fluorescerende spænding sensor. ITS er aktiveret for at fluorescerer hvis opretholde en molekylær spændinger, således konvertering kraft til fluorescerende signal på det molekylære niveau. Spænding tærsklen for ITS aktivering er afstemmelige i rækken af 10 – 60 pN, der dækker godt dynamikområde integrin spændinger i celler. På et substrat podet med en ITS, er integrin spændingen i vedhængende celler visualiseret ved fluorescens og afbildet på submicron opløsning. ITS er også kompatibel med celle strukturel billeddannelse i levende celler og faste celler. ITS har været anvendt med succes til studiet af trombocyt sammentrækning og celle migration. Dette papir beskriver proceduren for syntese og anvendelse af ITS i studiet af integrin overførte cellulære kraft.
Introduction
Celler stole på integriner at overholde og udøve cellulære styrker til ekstracellulære matrix. Integra-medieret celle vedhæftning og kraft transmission er afgørende for celle spredning1,2, migration3,4og overlevelse5,6,7. På lang sigt påvirkninger integrin biomekaniske signalering også celle spredning8,9,10 og differentiering11,12. Forskere har udviklet forskellige metoder til at måle og kort integrin overførte cellulære styrker på grænsefladen celle-matrix. Disse metoder er baseret på elastisk undergrundens13, array af micropost14, eller atomic force mikroskopi (AFM)15,16. Elastisk undergrundens og micropost metoder er afhængige af deformation af substrater til at rapportere den cellulært stress og har begrænsninger med hensyn til rumlige opløsning og tvinge følsomhed. AFM har høj kraft følsomhed, men det kan ikke afsløre kraft på flere steder samtidig, hvilket gør det vanskeligt at kortlægge cellulære kraft fremsendes integriner.
I de seneste år, blev flere teknikker udviklet for at studere cellulær kraft på molekylært niveau. En samling af molekylære spænding sensorer baseret på polyethylen glycol17,18, spider silke peptid19og DNA20,21,22,23 blev udviklet til visualisere og overvåge spændingen fremsendes molekylære proteiner. Blandt disse teknikker, blev DNA først vedtaget som syntese materiale i spændingen måle tether (TGT), en rupturable linker, der modulerer den øvre grænse for integrin spændinger i levende celler22,24. Senere, DNA og fluorescens resonans overførsel teknik blev kombineret til at oprette hårnål DNA-baserede fluorescerende spænding sensorer først af Chens gruppe23 og Salaitas gruppe20. Hårnål DNA-baserede spænding sensor rapporter integrin spændinger i real-tid og har været anvendt med succes til undersøgelse af en række cellulære funktioner21. Bagefter, kombineret Wang’s lab en TGT med fluorophore-quencher parret til betænkningen integrin spændinger. Denne sensor er opkaldt en ITS25,26. ITS er baseret på dobbelt-strenget DNA (dsDNA) og har et bredere dynamikområde (10-60 pN) til integrin spænding kalibrering. I modsætning til hårnål DNA-baserede sensorer, ITS rapporterer ikke cellulære kraft i realtid men registrerer alle historiske integrin begivenheder som fodaftryk af cellulære kraft; Dette signal ophobning proces forbedrer følsomheden for cellulære kraft imaging, der gør det muligt at billedet cellulære kraft selv med en low-end fluorescens mikroskop. Syntesen af ITS er relativt mere bekvemt, da det er skabt af hybridizing to enkeltstrenget DNAs (ssDNA).
ITS er en 18-base-parret dsDNA konjugeret med biotin, en fluorophore, en quencher (sort hul Quencher 2 [BHQ2])27og en cyklisk arginylglycylaspartic syre (M.H.T.) peptid28 som en integrin peptid ligand (figur 1). Den nederste linje er konjugeret med fluorophore (Cy3 er anvendt i dette manuskript, mens andre farvestoffer, såsom Cy5 eller Alexa serien, også har bevist, muligt i vores lab) og biotin tag, hvormed ITS er immobiliseret på et underlag af biotin-begærlighed bond. Den øvre strand er konjugeret med M.H.T. peptid og sort hul Quencher, der slukker Cy3 med ca 98% quenching effektivitet26,27. Med protokollen præsenteret i dette papir, er belægning tætheden af ITS på et substrat omkring 1.100/µm2. Dette er massefylden vi tidligere kalibreret for 18 bp biotinylated dsDNA belagt på neutrAvidin-functionalized underlaget ved at følge den samme belægning protokol29. Når celler overholder substrat belagt med ITS, integrin binder ITS gennem M.H.T. og transmitterer spænding til ITS. ITS har en specifik spænding tolerance (Ttol), der defineres som den spænding tærskelværdi, der mekanisk adskiller dsDNA ITS inden for 2 s22. SIT ruptur af integrin spændinger fører til adskillelsen af quencher fra farvestoffet, der efterfølgende udsender fluorescens. Som et resultat, den usynlige integrin spænding er konverteret til et fluorescens signal og den cellulære kraft kan kortlægges af fluorescens billeddannelse.
For at demonstrere anvendelsen af ITS, bruger vi fisk keratocyte her, udbredte celle model for celle migration undersøgelse30,31,32, CHO-K1 celle, almindeligt anvendte nonmotile cellelinje og NIH 3T3 fibroblast. Coimaging af integrin spændinger og celle strukturer er også gennemført.
Protocol
Representative Results
Discussion
ITS er en meget tilgængelig endnu kraftfulde teknik for cellulær tvinge kortlægning både syntese og anvendelse. Med alle materialer klar, kan ITS syntetiseres i 1 dag. Under eksperimenter, er kun tre trin af overfladebehandling nødvendig før celle plating. For nylig, vi yderligere forenklet proceduren belægning til et trin af direkte forbinder ITS til bovin serum albumin, som giver mulighed for direkte fysisk adsorption af ITS til glas eller polystyren overflader33. ITS bringer fluoresceren…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af fondens opstart fra Iowa State University og af National Institute of General Medical Sciences (R35GM128747).
Materials
| BSA-biotin | Sigma-Aldrich | A8549 | |
| Neutravidin | Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
| Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | 434301 | |
| upper strand DNA | Integrated DNA Technologies | N/A | Customer designed. DNA sequence is shown in PROTOCOL section |
| lower strand DNA | Integrated DNA Technologies | N/A | Customer designed. DNA sequences are shown in PROTOCOL section. |
| sulfo-SMCC | Thermo Fisher Scientific | A39268 | |
| Cyclic peptide RGD with an amine group | Peptides International | PCI-3696-PI | |
| IMDM | ATCC | 62996227 | |
| FBS | ATCC | 302020 | |
| Penicillin | gibco | 15140122 | |
| TCEP | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| 200 uL petri dish | Cellvis | D29-14-1.5-N | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | N/A | spectrometer |
| SE410 Tall Air-Cooled Vertical Protein Electrophoresis Unit | Hoefer | SE410-15-1.5 | Device for electroporesis |
| CHO-K1 cell line | ATCC | CCL-61 | |
| NIH/3T3 cell line | ATCC | CRL-1658 | |
| Anti-Vinculin Antibody | EMD Millipore | 90227 | Primary antibody for vinculin immunostaining |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Superclonal Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A28175 | Secondary antibody for vinculin immunostaining |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Invitrogen | A22287 | |
| Eclipse Ti | Nikon | N/A | microscope |
References
- Price, L. S., Leng, J., Schwartz, M. A., Bokoch, G. M. Activation of Rac and Cdc42 by Integrins Mediates Cell Spreading. Molecular Biology of the Cell. 9 (7), 1863-1871 (1998).
- Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands. Biophysical Journal. 92 (8), 2964-2974 (2007).
- Huttenlocher, A., Horwitz, A. R. Integrins in cell migration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (9), a005074 (2011).
- Hood, J. D., Cheresh, D. A. Role of integrins in cell invasion and migration. Nature Reviews Cancer. 2 (2), 91-100 (2002).
- Giancotti, F. G. Integrin signaling: specificity and control of cell survival and cell cycle progression. Current Opinion in Cell Biology. 9 (5), 691-700 (1997).
- Illario, M., et al. Integrin-Dependent Cell Growth and Survival Are Mediated by Different Signals in Thyroid Cells. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 88 (1), 260-269 (2003).
- Aoudjit, F., Vuori, K. Integrin Signaling in Cancer Cell Survival and Chemoresistance. Chemotherapy Research and Practice. 2012, 1-16 (2012).
- Hou, S., et al. Distinct effects of β1 integrin on cell proliferation and cellular signaling in MDA-MB-231 breast cancer cells. Scientific Reports. 6, 18430 (2016).
- Shankar, G., Davison, I., Helfrich, M. H., Mason, W. T., Horton, M. A. Integrin receptor-mediated mobilisation of intranuclear calcium in rat osteoclasts. Journal of Cell Science. 105 (Pt 1) (1), 61-68 (1993).
- Moreno-Layseca, P., Streuli, C. H. Signalling pathways linking integrins with cell cycle progression. Matrix Biology. 34, 144-153 (2014).
- Gómez-Lamarca, M. J., Cobreros-Reguera, L., Ibáñez-Jiménez, B., Palacios, I. M., Martín-Bermudo, M. D. Integrins regulate epithelial cell differentiation by modulating Notch activity. Journal of Cell Science. 127 (Pt 1), 4667-4678 (2014).
- Wang, H., Luo, X., Leighton, J. Extracellular Matrix and Integrins in Embryonic Stem Cell Differentiation. Biochemistry Insights. 8 (Suppl 1), 15-21 (2015).
- Schwarz, U. S., Soiné, J. R. D. Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular Cell Research. 1853 (11), 3095-3104 (2015).
- Xie, T., Hawkins, J., Sun, Y., Rittié, L. Traction Force Measurement Using Deformable Microposts. Fibrosis. Methods and Protocols. , 235-244 (2017).
- Radmacher, M. Studying the Mechanics of Cellular Processes by Atomic Force Microscopy. Methods in Cell Biology. 83, 347-372 (2007).
- Charras, G. T., Lehenkari, P. P., Horton, M. A. Atomic force microscopy can be used to mechanically stimulate osteoblasts and evaluate cellular strain distributions. Ultramicroscopy. 86 (1-2), 85-95 (2001).
- Miller, J. S., et al. Bioactive hydrogels made from step-growth derived PEG-peptide macromers. Biomaterials. 31 (13), 3736-3743 (2010).
- Legant, W. R., Miller, J. S., Blakely, B. L., Cohen, D. M., Genin, G. M., Chen, C. S. Measurement of mechanical tractions exerted by cells within three-dimensional matrices. Nature Methods. 7 (12), 969 (2010).
- Brenner, M. D., et al. Spider Silk Peptide Is a Compact, Linear Nanospring Ideal for Intracellular Tension Sensing. Nano Letters. 16 (3), 2096-2102 (2016).
- Zhang, Y., Ge, C., Zhu, C., Salaita, K. DNA-based digital tension probes reveal integrin forces during early cell adhesion. Nature Communications. 5, 5167 (2014).
- Liu, Y., et al. DNA-based nanoparticle tension sensors reveal that T-cell receptors transmit defined pN forces to their antigens for enhanced fidelity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5610-5615 (2016).
- Wang, X., Ha, T. Defining Single Molecular Forces Required to Activate Integrin and Notch Signaling. Science. 340 (6135), (2013).
- Blakely, B. L., et al. A DNA-based molecular probe for optically reporting cellular traction forces. Nature Methods. 11 (12), 1229-1232 (2014).
- Wang, Y., Wang, X. Integrins outside focal adhesions transmit tensions during stable cell adhesion. Scientific Reports. 6 (1), 36959 (2016).
- Wang, Y., et al. Force-activatable biosensor enables single platelet force mapping directly by fluorescence imaging. Biosensors and Bioelectronics. 100, 192-200 (2018).
- Zhao, Y., Wang, Y., Sarkar, A., Wang, X. Keratocytes Generate High Integrin Tension at the Trailing Edge to Mediate Rear De-adhesion during Rapid Cell Migration. iScience. 9, 502-512 (2018).
- Crisalli, P., Kool, E. T. Multi-Path Quenchers: Efficient Quenching of Common Fluorophores. Bioconjugate Chemistry. 22 (11), 2345-2354 (2011).
- Mondal, G., Barui, S., Chaudhuri, A. The relationship between the cyclic-RGDfK ligand and αvβ3 integrin receptor. Biomaterials. 34 (26), 6249-6260 (2013).
- Wang, X., et al. Integrin Molecular Tension within Motile Focal Adhesions. Biophysical Journal. 109 (11), 2259-2267 (2015).
- Euteneuer, U., Schliwa, M. Persistent, directional motility of cells and cytoplasmic fragments in the absence of microtubules. Nature. 310 (5972), 58-61 (1984).
- Kucik, D. F., Elson, E. L., Sheetz, M. P. Cell migration does not produce membrane flow. The Journal of Cell Biology. 111 (4), 1617-1622 (1990).
- Mueller, J., et al. Load Adaptation of Lamellipodial Actin Networks. Cell. , (2017).
- Sarkar, A., Zhao, Y., Wang, Y., Wang, X. Force-activatable coating enables high-resolution cellular force imaging directly on regular cell culture surfaces. Physical Biology. 15 (6), 065002 (2018).
- Mosayebi, M., Louis, A. A., Doye, J. P. K., Ouldridge, T. E. Force-Induced Rupture of a DNA Duplex: From Fundamentals to Force Sensors. ACS Nano. 9 (12), 11993-12003 (2015).
- Bockelmann, U., Essevaz-Roulet, B., Heslot, F. Molecular Stick-Slip Motion Revealed by Opening DNA with Piconewton Forces. Physical Review Letters. 79 (22), 4489-4492 (1997).
- Krautbauer, R., Rief, M., Gaub, H. E. Unzipping DNA oligomers. Nano Letters. 3 (4), 493-496 (2003).
- de Gennes, P. G. Maximum pull out force on DNA hybrids. Comptes Rendus de l’Académie des Sciences – Series IV – Physics. 2 (10), 1505-1508 (2001).
- Hatch, K., Danilowicz, C., Coljee, V., Prentiss, M. Demonstration that the shear force required to separate short double-stranded DNA does not increase significantly with sequence length for sequences longer than 25 base pairs. Physical Review E. 78 (1), 011920 (2008).
