इमेजिंग Integrin तनाव और सेलुलर बल Submicron संकल्प पर एक एकीकृत तनाव सेंसर के साथ
Summary
Integrin तनाव विभिंन सेल कार्यों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । एक एकीकृत तनाव संवेदक के साथ, integrin तनाव picoNewton (पीएन) संवेदनशीलता के साथ calibrated है और submicron संकल्प पर imaged ।
Abstract
Integrin-ligand बांड द्वारा प्रेषित आणविक तनाव integrin मार्ग है कि कई सेल कार्यों और व्यवहार में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता में मौलिक यांत्रिक संकेत है । जांच करने के लिए और उच्च बल संवेदनशीलता और स्थानिक संकल्प के साथ छवि integrin तनाव, हम एक एकीकृत तनाव संवेदक (इसके), एक डीएनए आधारित फ्लोरोसेंट तनाव सेंसर विकसित की है । इसकी फ्लोरेस्क को सक्रिय किया जाता है यदि एक आणविक तनाव को बनाए रखने, इस प्रकार आणविक स्तर पर प्रतिदीप्त संकेत करने के लिए बल परिवर्तित । इसके सक्रियकरण के लिए तनाव सीमा 10 – 60 पीएन की श्रेणी में स्वरित्र है जो अच्छी तरह से कोशिकाओं में integrin तनाव की गतिशील रेंज को शामिल किया गया है । एक सब्सट्रेट के साथ grafted पर, आसंन कोशिकाओं के integrin तनाव प्रतिदीप्ति और सब्सट्रेट संकल्प पर imaged द्वारा कल्पना की है । इसके अलावा दोनों जीवित कोशिकाओं और स्थिर कोशिकाओं में कोशिका संरचनात्मक इमेजिंग के साथ संगत है । इसकी सफलतापूर्वक प्लेटलेट संकुचन और कोशिका प्रवास के अध्ययन के लिए लागू किया गया है । इस कागज के संश्लेषण और integrin-संचारित सेलुलर बल के अध्ययन में अपने आवेदन के लिए प्रक्रिया का विवरण ।
Introduction
कोशिकाओं का पालन करने के लिए integrins पर निर्भर करते हैं और कोशिकीय मैट्रिक्स के लिए सेलुलर बलों डालती. Integrin-मध्यस्थता सेल आसंजन और सेना संचरण1,2, प्रवास3,4, और जीवन रक्षा5,6,7फैल सेल के लिए महत्वपूर्ण हैं । लंबी अवधि में, integrin biomechanical संकेतन भी प्रभावित करता है सेल प्रसार8,9,10 और विभेदन11,12। शोधकर्ताओं ने कोशिका-मैट्रिक्स इंटरफेस पर integrin-संचारित सेलुलर बलों को मापने और मैप करने के लिए विभिन्न तरीके विकसित किए हैं । इन पद्धतियों के आधार पर कर रहे है लोचदार बुनियाद13, सरणी micropost14, या परमाणु फोर्स micropost (afm)15,16। लोचदार बुनियाद और micropost तरीकों सेलुलर तनाव की रिपोर्ट के लिए बुनियाद के विरूपण पर भरोसा करते हैं और स्थानिक संकल्प और बल संवेदनशीलता के मामले में सीमाएं हैं. AFM उच्च शक्ति की संवेदनशीलता है, लेकिन यह एक साथ कई स्थानों पर बल का पता लगाने के लिए, यह मुश्किल सेलुलर integrins द्वारा प्रेषित बल मैप करने के लिए कर सकते हैं ।
हाल के वर्षों में, आणविक स्तर पर सेलुलर बल का अध्ययन करने के लिए कई तकनीकों का विकास किया गया था । पॉलीथीन ग्लाइकोल17,18, स्पाइडर सिल्क पेप्टाइड19, और डीएनए20,21,22,23 पर आधारित आणविक तनाव सेंसर का एक संग्रह विकसित किया गया कल्पना और आणविक प्रोटीन द्वारा प्रेषित तनाव की निगरानी । इन तकनीकों में, डीएनए पहले तनाव गेज तार में संश्लेषण सामग्री के रूप में अपनाया गया था (TGT), एक rupturable linker कि जीवित कोशिकाओं में integrin तनाव की ऊपरी सीमा modulates22,24. बाद में, डीएनए और प्रतिदीप्ति अनुनाद अंतरण तकनीक को संयुक्त रूप से हेयरपिन डीएनए आधारित फ्लोरोसेंट तनाव सेंसर बनाया गया, जो चेन के समूह23 और सबिता के समूह20द्वारा पहले किया गया था । हेयरपिन डीएनए आधारित तनाव सेंसर रीयल-टाइम में इंटीरिइन टेंशन की रिपोर्ट करता है और इसे सेलुलर फंक्शन्स21की एक सीरीज के अध्ययन में सफलतापूर्वक लागू किया गया है । इसके बाद, वांग की प्रयोगशाला ने एक TGT को फ्लूओफोर-क्वान्चर जोड़ी के साथ एकीकृत करके तनाव की रिपोर्ट की । इस सेंसर का नाम है एक इसके25,26। इसकी डबल-फंसे डीएनए (dsDNA) पर आधारित है और integrin तनाव अंशांकन के लिए एक व्यापक गतिशील रेंज (10-60 pN) है । हेयरपिन डीएनए-आधारित सेंसरों के विपरीत, यह वास्तविक समय में सेलुलर बल की रिपोर्ट नहीं करता है, लेकिन सेलुलर बल के पदचिह्न के रूप में सभी ऐतिहासिक integrin घटनाओं रिकॉर्ड; यह संकेत संचय प्रक्रिया सेलुलर फोर्स इमेजिंग के लिए संवेदनशीलता को बेहतर बनाता है, यह एक कम अंत प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ भी छवि सेलुलर बल के लिए व्यवहार्य बना रही है । इसका संश्लेषण अपेक्षाकृत अधिक सुविधाजनक होता है क्योंकि यह दो एकल-असहाय DNAs (ssDNA) को संकरित करके बनाया जाता है ।
इसकी एक 18-बेस-युग्मित dsdna biotin के साथ संयुग्मित, एक fluorophore, एक शामक (ब्लैक होल शामक 2 [BHQ2])27, और एक चक्रीय arginylglycylaspartic एसिड (rgd) के रूप में28 पेप्टाइड एक integrin पेप्टाइड लिगामेंट (चित्रा 1). लोअर strand फ्लोरोफोर (Cy3 इस पांडुलिपि में प्रयोग किया जाता है के साथ संयुग्मित है, जबकि अंय रंगों, जैसे Cy5 या Alexa श्रृंखला के रूप में, यह भी हमारे प्रयोगशाला में संभव सिद्ध किया गया है) और बायोटिन टैग, जिसके साथ अपने बायोटिन-avidin बांड द्वारा एक सब्सट्रेट पर immobilized है । ऊपरी किनारा rgd पेप्टाइड और ब्लैक होल quencher, जो लगभग ९८% शमन क्षमता के साथ Cy3 quencher के साथ संयुग्मित है26,27। इस पत्र में प्रस्तुत प्रोटोकॉल के साथ, एक सब्सट्रेट पर इसकी कोटिंग घनत्व 1100/μm2के आसपास है । यह घनत्व हम पहले 18 बीपी biotinylated dsDNA के लिए calibrated है neutrAvidin-functionalized सब्सट्रेट पर लेपित उसी कोटिंग प्रोटोकॉल29का पालन करके । जब कोशिकाओं को अपने साथ लेपित सब्सट्रेट का पालन, integrin अपने RGD के माध्यम से बांधता है और इसके लिए तनाव पहुंचाता । इसकी एक विशिष्ट तनाव सहिष्णुता (टीटोल) जो तनाव सीमा के रूप में परिभाषित किया गया है कि यंत्रवत् 2 एस22के भीतर के dsdna अलग है । Integrin तनाव द्वारा इसका टूटना डाई कि बाद में प्रतिदीप्ति उत्सर्जित से शामक के जुदाई की ओर जाता है । परिणामस्वरूप, अदृश्य समांतक तनाव प्रतिदीप्ति संकेत में परिवर्तित हो जाता है और सेलुलर बल प्रतिदीप्ति इमेजिंग द्वारा प्रतिचित्रित किया जा सकता है ।
इसके लिए आवेदन प्रदर्शित करने के लिए, हम मछली keratocyte यहां का उपयोग करें, सेल प्रवास के अध्ययन के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया सेल मॉडल30,31,३२, चो-K1 सेल, एक आमतौर पर इस्तेमाल किया अचल सेल लाइन, और nih 3t3 फाइलब्लास्ट । Integrin तनाव और कोशिका संरचनाओं के कोइन्एजिंग भी आयोजित किया जाता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
अपने दोनों संश्लेषण और आवेदन के संदर्भ में सेलुलर फोर्स मानचित्रण के लिए एक उच्च सुलभ अभी तक शक्तिशाली तकनीक है. सभी के लिए तैयार सामग्री के साथ, इसके 1 दिन के भीतर संश्लेषित किया जा सकता है । प्रयोगों के…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम स्टार्टअप कोष द्वारा समर्थित किया गया था आयोवा राज्य विश्वविद्यालय द्वारा प्रदान की और राष्ट्रीय सामांय चिकित्सा विज्ञान संस्थान (R35GM128747) ।
Materials
| BSA-biotin | Sigma-Aldrich | A8549 | |
| Neutravidin | Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
| Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | 434301 | |
| upper strand DNA | Integrated DNA Technologies | N/A | Customer designed. DNA sequence is shown in PROTOCOL section |
| lower strand DNA | Integrated DNA Technologies | N/A | Customer designed. DNA sequences are shown in PROTOCOL section. |
| sulfo-SMCC | Thermo Fisher Scientific | A39268 | |
| Cyclic peptide RGD with an amine group | Peptides International | PCI-3696-PI | |
| IMDM | ATCC | 62996227 | |
| FBS | ATCC | 302020 | |
| Penicillin | gibco | 15140122 | |
| TCEP | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| 200 uL petri dish | Cellvis | D29-14-1.5-N | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | N/A | spectrometer |
| SE410 Tall Air-Cooled Vertical Protein Electrophoresis Unit | Hoefer | SE410-15-1.5 | Device for electroporesis |
| CHO-K1 cell line | ATCC | CCL-61 | |
| NIH/3T3 cell line | ATCC | CRL-1658 | |
| Anti-Vinculin Antibody | EMD Millipore | 90227 | Primary antibody for vinculin immunostaining |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Superclonal Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A28175 | Secondary antibody for vinculin immunostaining |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Invitrogen | A22287 | |
| Eclipse Ti | Nikon | N/A | microscope |
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