Tensão de integrina tem um papel importante em várias funções da célula. Com um sensor de tensão Integrativa, integrina tensão é calibrado com sensibilidade de picoNewton (pN) e cuja imagem em resolução de submicron.
Tensão molecular transmitido pelos títulos de integrina-ligante é o sinal mecânico fundamental na via da integrina que tem um papel significativo em muitas funções celulares e comportamentos. Para calibrar e imagem integrina tensão com força alta sensibilidade e resolução espacial, desenvolvemos um sensor de tensão Integrativa (ITS), um sensor de tensão fluorescente baseado em DNA. O SIB é ativado para fluorescência se sustentar uma tensão molecular, convertendo assim força de sinal fluorescente a nível molecular. O limite de tensão para sua ativação é ajustável na faixa de 10 a 60 pN que cobre bem a gama dinâmica de integrina tensão nas células. Sobre um substrato enxertado com um ITS, a integrina tensão das células aderentes é visualizada por fluorescência e fotografada em resolução de submicron. O SIB é também compatível com imagem estrutural de célula em células vivas e células fixas. O SIB foi aplicado com êxito para o estudo da contração das plaquetas e a migração celular. Este documento detalha o procedimento para a síntese e a aplicação do SIB no estudo da força celular integrina-transmitidos.
Células dependem de integrinas de aderir e exercer forças celulares de matriz extracelular. Transmissão de força e adesão celular mediada por integrina são cruciais para a célula espalhando1,2, migração3,4e sobrevivência5,6,7. A longo prazo, integrina biomecânico sinalização também influi na célula proliferação8,9,10 e diferenciação11,12. Pesquisadores desenvolveram vários métodos para medir e celular de integrina transmissíveis mapa forças na interface célula-matriz. Estes métodos baseiam-se em substrato elástico13, matriz de micropost14, ou atômica força microscopia (AFM)15,16. Elástica substrato e micropost métodos dependem da deformação de substratos para relatar o estresse celular e têm limitações em termos de resolução espacial e forçar a sensibilidade. AFM tem força alta sensibilidade, mas que não consigo detectar a força em vários pontos simultaneamente, dificultando a mapear celular força transmitida por integrinas.
Nos últimos anos, várias técnicas foram desenvolvidas para estudar a força celular a nível molecular. Uma coleção de sensores de tensão molecular baseado em polietileno glicol17,18, aranha de seda peptídeo19e DNA20,21,22,23 foram desenvolvidos para Visualizar e monitorar a tensão transmitida por proteínas moleculares. Entre essas técnicas, o DNA foi adotado inicialmente como o material de síntese na tensão calibre baraço (TGT), um rupturable vinculador que modula o limite superior da integrina tensões em células vivas22,24. Mais tarde, técnica de transferência de ressonância de DNA e fluorescência foram combinados para criar prendendor sensores de tensão fluorescente baseado em DNA primeiro por grupo23 de Chen e grupo20 do Salaita. O sensor de tensão baseado em DNA prendendor relata integrina tensão em tempo real e tem sido aplicado com sucesso para o estudo de uma série de funções celulares21. Depois, o laboratório de Wang combinado um TGT com o par de fluoróforo-quencher para tensão de integrina relatório. Este sensor é chamado um ITS25,26. O SIB é baseado em DNA de cadeia dupla (dsDNA) e tem um alcance dinâmico mais amplo (pN 10-60) para a calibração de tensão integrina. Em contraste com o gancho de cabelo DNA baseado em sensores, o SIB não relata força celular em tempo real mas registra todos os eventos de integrina histórico como a pegada da força celular; Este processo de acumulação de sinal melhora a sensibilidade para celular força de imagem, tornando-o viável para celular força de imagem mesmo com um microscópio de fluorescência low-end. A síntese de ITS é relativamente mais conveniente, pois ele é criado pelo cruzamento de dois single-stranded DNA (ssDNA).
O ITS é uma 18-base-emparelhado dsDNA conjugado com biotina, um fluoróforo, um quencher (buraco negro Quencher 2 [BHQ2])27e um ácido (RGD) cíclico arginylglycylaspartic peptídeo28 como um ligante de peptídeo de integrina (Figura 1). O fio inferior é conjugado com o fluoróforo (Cy3 é usado neste manuscrito, enquanto outros corantes, tal como a série Cy5 ou Alexa, também têm sido comprovada viável em nosso laboratório) e a tag de biotina, com o qual o SIB é imobilizado em um substrato por ligação biotina-avidina. A vertente superior é conjugada com o peptídeo RGD e o buraco negro Quencher, que sacia Cy3 com aproximadamente 98% têmpera eficiência26,27. Com o protocolo apresentado neste trabalho, a densidade de revestimento do SIB em um substrato é em torno de 1.100/µm2. Esta é a densidade de que nós previamente calibrados para 18 bp biotinilado dsDNA revestido no substrato neutrAvidin-acrescida, seguindo o mesmo protocolo29de revestimento. Quando as células aderem ao substrato revestido com o SIB, integrina vincula o SIB através de RGD e transmite a tensão para o SIB. O ITS tem uma tolerância de tensão específica (Ttol) que é definida como o limiar de tensão que separa mecanicamente o dsDNA do SIB dentro 2 s22. SUA ruptura por tensão integrina leva à separação do quencher da tintura que posteriormente emite fluorescência. Como resultado, a tensão de integrina invisível é convertida para um sinal de fluorescência e a força de celular pode ser mapeada por imagens de fluorescência.
Para demonstrar a aplicação do SIB, usamos keratocyte peixe aqui, um modelo de célula amplamente utilizada para a migração celular estudo30,31,de32, células CHO-K1, uma linhagem celular de imóveis usados e fibroblastos de NIH 3T3. Coimaging de estruturas de tensão e célula de integrina também é conduzida.
O SIB é um altamente acessível ainda poderosa técnica para celular mapeamento em termos de síntese e a aplicação de força. Com todos os materiais prontos, o ITS podem ser sintetizados dentro de 1 dia. Durante as experiências, apenas três passos do revestimento de superfície são necessários antes de chapeamento de célula. Recentemente, simplificou ainda mais o procedimento de revestimento de um passo vinculando diretamente o ITS a albumina de soro bovino, que permite a adsorção física direta do SIB para vi…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado pelo fundo de inicialização fornecido pela Iowa State University e pelo Instituto Nacional de General Medical Ciências (R35GM128747).
BSA-biotin | Sigma-Aldrich | A8549 | |
Neutravidin | Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | 434301 | |
upper strand DNA | Integrated DNA Technologies | N/A | Customer designed. DNA sequence is shown in PROTOCOL section |
lower strand DNA | Integrated DNA Technologies | N/A | Customer designed. DNA sequences are shown in PROTOCOL section. |
sulfo-SMCC | Thermo Fisher Scientific | A39268 | |
Cyclic peptide RGD with an amine group | Peptides International | PCI-3696-PI | |
IMDM | ATCC | 62996227 | |
FBS | ATCC | 302020 | |
Penicillin | gibco | 15140122 | |
TCEP | Sigma-Aldrich | C4706 | |
200 uL petri dish | Cellvis | D29-14-1.5-N | |
NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | N/A | spectrometer |
SE410 Tall Air-Cooled Vertical Protein Electrophoresis Unit | Hoefer | SE410-15-1.5 | Device for electroporesis |
CHO-K1 cell line | ATCC | CCL-61 | |
NIH/3T3 cell line | ATCC | CRL-1658 | |
Anti-Vinculin Antibody | EMD Millipore | 90227 | Primary antibody for vinculin immunostaining |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Superclonal Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A28175 | Secondary antibody for vinculin immunostaining |
Alexa Fluor 647 Phalloidin | Invitrogen | A22287 | |
Eclipse Ti | Nikon | N/A | microscope |