Humant indusert pluripotent stilk cellen (hiPSC)-avledet intestinal organoids tilbyr spennende muligheter til å modellere enteric sykdommer in vitro. Vi viser differensiering av hiPSCs i intestinal organoids (iHOs), stimulering av disse iHOs med cytokiner, og microinjection av Salmonella Tyfimurium i iHO lumen, slik at studiet av en epitel invasjon av denne Patogen.
Intestinal ‘ organoid ‘ (iHO) system, karakterisert ved at 3-D strukturer representant for epitel slimhinnen i den menneskelige tarmen kan produseres fra humane indusert Pluripotent stamceller (hiPSCs) og vedlikeholdes i kultur, gir en spennende mulighet til å tilrettelegge modellering av epitel responsen til enteric infeksjoner. In vivo, intestinal epitelceller (IECs) spiller en nøkkelrolle i å regulere intestinal homeostase og kan direkte hemme patogener, selv om mekanismene som dette skjer er ikke fullt belyst. Den cytokin interleukin-22 (IL-22) har vist å spille en rolle i vedlikehold og forsvar av tarmen epitel barriere, inkludert inducing en utgivelse av antimikrobielle peptider og chemokiner som svar på infeksjon.
Vi beskriver differensiering av sunn kontroll hiPSCs i iHOs via tillegg av spesifikke cytokin kombinasjoner til deres kultur medium før embedding dem inn i en kjeller membran matrise-basert prointestinal kultur system. Når innebygd, er iHOs vokst i Media supplert med noggin, R-spondin-1, epidermal vekstfaktor (EGF), CHIR99021, prostaglandin E2, og Y-27632 dihydrochloride monohydrat. Ukentlig passasjer ved manuell forstyrrelse av iHO Ultrastructure føre til dannelsen av budded iHOs, med noen viser en krypten/villus struktur. Alle iHOs demonstrere et differensiert epitel bestående av begeret celler, enteroendocrine celler, Paneth celler, og polarisert enterocytes, som kan bekreftes via immunostaining for bestemte markører for hver celle delsett, overføring elektron mikroskopi (TEM), og kvantitativ PCR (qPCR). Til modell infeksjon, Salmonella ENTERICA serovar tyfimurium SL1344 er microinjected inn i lumen av iHOs og inkubert for 90 min ved 37 ° c, og en modifisert Gentamicin beskyttelse analysen er utført for å identifisere nivåer av intracellulære bakteriell invasjon. Noen iHOs er også forbehandlet med rekombinant Human IL-22 (rhIL-22) før infeksjon for å fastslå om dette cytokin er beskyttende mot Salmonella infeksjon.
I de senere årene har studiet av verts-patogen interaksjoner blitt forsterket av utviklingen av ‘ organoid ‘ modeller, hvor 3-D representasjoner av tarm epitel kan produseres fra ulike forfedre. ‘ Primary ‘ organoids kan genereres direkte fra intestinal stamceller høstes fra intestinal biopsier. I tillegg kan intestinal organoids genereres fra hiPSCs. Det samme kan sies om mange vev, med mage1, lever2, bukspyttkjertelen3,4, Brain5,6, lunge7, og prostata8 organoids brukes av mange forskere til å modellere Sykdom. Det er mange spennende anvendelser av organoid systemet, inkludert modellering kreft9 og Drug screening10, men her fokuserer vi på bruk av iHOs som en infeksjon modell, bruker S. enterica serovar Tyfimurium (S. Tyfimurium) som en eksemplarisk patogen og forbehandling med IL-22 som terapi.
I denne studien, hiPSCs brukes til å generere iHO er ‘ Kolf2 ‘ iPSCs, generert fra en sunn individ og tilgjengelig fra Human indusert pluripotent Stem Cells Initiative Consortium (HipSci; www.hipsci.org), en åpen tilgang referansepanel av preget hiPSC linjer11. En fordel med å bruke hiPSCs som forfedre for organoids er at det nå er omfattende banker av sunn donor iPSC linjer tilgjengelig, noe som betyr at resultatene kan valideres i en rekke cellelinjer med ulike genetiske bakgrunner. I tillegg bør forskerne ønsker å se på spesifikke sykdom-forbundet enkelt nukleotid polymorfismer (SNPs), er det mulig å bruke CRISPR/Cas9 til ingeniør mutasjoner i en sunn cellelinje, og dermed produsere både en mutert linje og beholde isogenic kontroll linje for sammenligning12. I vår erfaring, hiPSC-avledet intestinal organoids er større i størrelse enn sine primære motstykker og mer konsistent i kultur, noe som gjør for en mindre teknisk utfordrende microinjection og potensielt gir et mer mangfoldig spekter av patogener skal Studerte. iHOs kan bli cryogenically bevart, og vi har spredd iHO kulturer i inntil et år for å produsere materiale for eksperimentering.
In vivo, IECs spille en nøkkelrolle i å regulere intestinal homeostase og kan direkte hemme patogener, selv om mekanismene som dette skjer er ikke godt forstått. Den cytokin IL-22 er kjent for å ha en rolle i vedlikehold av tarmen epitel barriere13 og er involvert i induksjon og sekresjon av antimikrobielle peptider og chemokiner som svar på infeksjon14. Det er produsert av aktiverte T-celler (spesielt, Th17 celler) så vel som av Natural Killer (NK) celler og binder seg til en heterodimeric reseptor sammensatt av IL-22R1 og IL-10R2 under enheter15. Reseptoren for IL-22 er uttrykt basally på IECs, noe som betyr at i iHO modellen, er det mulig å forbehandle organoids med rhIL-22 bare ved sitt tillegg til kultur medium16. En ulempe ved organoid systemet er at den mangler den tilhørende immunresponsen normalt levert av andre immun celletyper; Imidlertid, modeller er Emerging det prøve å coculture organoids med intestinal lymfocytter å bedre forestiller denne17,18.
Bruken av microinjection systemet er nøkkelen til å simulere infeksjoner i iHO modellen, siden dette tillater direkte levering av patogener til den apikale overflaten av epitel, som ville skje i tilfelle av in vivo infeksjon. Tillegg av fenol rød til bakteriell løsning injisert i iHO markerer de som har blitt smittet, og dermed unngår gjentatte injeksjoner av samme iHO. Organoids som fartøy for smitte modellering er økende i bruk, med patogener som Helicobacter pylori,19 Norovirus,20 rotavirus,21 Shiga gift-produserende Escherichia coli22, Cryptosporidium23, og det Zika viruset24 har blitt vist å overleve og gjenskape innenfor disse systemene. Denne teknologien kan anvendes på et bredere spekter av patogener, spesielt til organismer som er vanskelig å kultur, for eksempel protozoer, eller menneskelige begrensede patogener, for å få direkte informasjon om den menneskelige epitel respons på infeksjon.
Denne protokollen skisserer differensiering av hiPSCs i iHOs og deres nytte som en modell for å simulere enteric infeksjoner. Nedenfor skisserer vi de kritiske trinnene i protokollen og eventuelle modifikasjoner eller forbedringer vi har gjort.
Denne protokollen effektiviserer differensiering prosessen med hiPSCs sammenlignet med tidligere publisert arbeid25. Tidligere brukte metoder krevde overføring av hiPSCs fra andre hiPSC kultur systemer (f. eks, mater-avhengige hiPSC kultur) til kjemisk definert medium-polyvinylklorid (CDM-PVA). Denne overføringen til CDM-PVA tar vanligvis 2 – 3 uker og krever daglig fôring av hiPSCs. Denne protokollen var heller ikke konsekvent effektiv, med noen differentiations sviktende; Derfor trialed vi differensiering ved hjelp av de samme vekst faktorene, men starter med hiPSCs vokst i Stamcelle kulturen medium (i stedet for CDM-PVA) og utskifting av CDM-PVA med stilk cellen kulturen medium under differensiering dager 0 – 3. Dette har vært vellykket for de fem uavhengige hiPSC linjer trialed så langt, noe som gjør differensiering prosessen mye raskere og effektiv. Dette gjør det også mulig Helge fri dyrking av hiPSCs før differensiering, slik at mer fleksibilitet i hiPSC kulturen. iHO linjer produsert av denne metoden har vært phenotyped for markører av intestinal epitel som vi tidligere har beskrevet for hiPSC linjene Kolf2, Yemz1, og Lise116 og vises phenotypically skilles fra iHOs produsert ved hjelp av forrige Protokollen.
Etter seeding, iHOs krever minst 1 måned rutinemessig passaging, med splitting hver 4-7 dager for å lette modning. Merk at det vil være noen variasjon i iHO utvikling avhengig av iPSC linjen som brukes og tettheten av den opprinnelige kulturen. I løpet av de første avsnittene, vil det være synlig forurensende celler som ikke er iHOs. Disse vil til slutt dø, etterlot en ren kultur av sfærisk og, etter ca 4 uker, budded iHOs. I tillegg kan en in-Hood Imaging system brukes til å velge og passasje bare iHOs med ønsket morfologi. Som iHOs eldre, vil de kreve splitting hver 6-7 dager, avhengig av vekst og tetthet. Hvis noen av følgende oppstår, iHOs bør deles før dette punktet: den luminal hulrom i iHOs begynner å fylle opp med døde celler, begynner kjelleren membran matrise å oppløses, den iHOs begynner å vokse ut av kjelleren membran matrise, eller kulturen er for tett og Media begynner å gå gult svært raskt.
Når iHO kulturen er etablert, hvis noen gang utseendet på iHOs endringer eller er annerledes enn forventet (for eksempel kulturer forblir sfærisk, snarere enn spirende), bestemmelse av fenotype via immunhistokjemi og qPCR for celle markører bør gjentas for å sikre at differensiering av celletyper i iHOs (f. eks, begeret celler, Paneth celler) forblir intakt. Hvis iHOs ikke lenger er unike, så de bør kastes og redifferentiated eller en tidligere passasje av iHOs bør Tint og rekonstituert. Hvis iHOs opphøre å skille, de potensielle årsakene er en alder av kulturen (hvis det er over 6 måneder gammel), aktiviteten av vekstfaktorer (sikre at disse er tilberedt i henhold til produsentens instruksjoner og holdt frosset i små alikvoter å unngå flere fryse-tine sykluser), for hyppige eller voldelige passasjer (generelt, passaging bør bare forekomme en gang i uken, og hvis iHOs er manuelt dissosiert for kraftig med jevne mellomrom, vil de slutte å fullt differensiere).
Vi etablerte via RNA sekvensering at IL-22 stimulering 18 h før infeksjon upregulates antimikrobielle gener og de som er involvert i barriere forsvaret fenotype. Før bruk av nye iHsO for analyser som involverer prestimulation med rhIL-22 (eller en alternativ cytokin hvis systemet blir brukt til dette), er det tilrådelig å sjekke aktiviteten av gener kjent for å være upregulated av cytokin (i tilfelle av IL-22 , brukte vi DUOX2 og LCN2) via QPCR etter stimulering av iHOs, for å sikre reseptor uttrykk og intakt signal. Før den første bruk av IL-22, vi også gjennomført immunhistokjemi å finne IL-22 reseptor på iHOs å fastslå at uttrykket av IL-22 reseptoren var basal, noe som betyr at prestimulation kan oppnås ved å legge rhIL-22 til iHO kulturen Medium. Men hvis en reseptor er apically uttrykt, kan denne protokollen må tilpasses for å levere ligander apically.
Fallgruver om microinjection systemet er generelt knyttet til delikatesse av nålene som kreves for injeksjon. Her bruker vi kommersielt tilgjengelige bore spisser med 6 μm lumen. Det er mulig å trekke injeksjon nåler fra glass blodkar26 selv om dette kan være mindre ensartet, fører til lekkasjer fra nålen spissen eller inkonsekvent volumer blir injisert i iHOs. Det er viktig å være sikker på at injeksjonen har funnet sted i iHO lumen, som er en årsak til bruk av fenol rød som et fargestoff; den iHOs vil synlig utvide og holde den røde inokulum, slik at sikkerhet om hvilke iHOs har blitt injisert. Noen ganger nåler vil tette med rusk fra iHO veggen; Hvis dette er tilfelle, fjerner du nålespissen fra innsiden av iHO og trykker på Clean -knappen på microinjection systemet. Dette vil produsere en kort periode med høyere lufttrykk som skal fjerne blokkeringen. Det vil også indusere noen lekkasje av bakteriell inokulum på tallerkenen; Derfor, hvis dette skjer, bør ren handling gjentas på alle platene for å sikre likestilling av bakteriell inokulum per plate. En stor fordel med den hiPSC-avledede iHOs er deres størrelse. Intestinal organoids fra mus og primære menneskelige organoids er mye mindre (måle opp til ~ 100 μm og 100-300 μm, henholdsvis27, versus 250-1500 μm for hiPSC-avledet iHOs), noe som betyr at injeksjoner av store mengder organoids vil bli tregere. Dette gjør at sprøyte eksperimenter med større skala kan trialed i det hiPSC-avledede iHOs. Det er en likeledes mulig å studere det luminal innholdet av det iHOs av innhøsting seg postinfection og manuelt dissociating det iHOs i DPBS, frigir deres luminal innholdet. For microinjection, anbefaler vi å bruke en høy konsentrasjon av bakterier. Vi fant at lavere konsentrasjoner ikke var tilstrekkelig til å generere et svar fra IECs bestående av iHOs. I tillegg var det vanskelig å senere finne internalisert bakterier ved hjelp av mikroskopi. Inokulum må kanskje optimaliseres for ulike bakteriestammer.
Oppsummert hiPSC-avledet iHOs gi en lovende modell for direkte dissekere epitel responsen til enteric infeksjoner, enten ved å studere intracellulære invasjon teller, Imaging, måle cytokin nivåer i iHO supernatanter, eller høsting RNA til studere transcriptional endringer etter eksponering for patogener. Deres nytte vil bli enda mer tydelig i fremtiden for å etablere smitte modeller for Human-begrensede patogener og i å utnytte mulighetene for å bruke denne teknologien til å tilpasse forskning ved å studere spesifikke sykdom-relaterte genetiske mutasjoner og narkotika responser.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av finansiering fra The Wellcome Trust, The Gates Foundation, og Cambridge Biomedical Research Centre. E.A.L. er en klinisk Ph.D. student som støttes av Wellcome Trust.
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-10ML | |
5 mm glass bottom injection dishes | MatTek corporation | P50G-0-14-F | |
Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634010 | |
Alexa fluor 647 phalloidin | Life Technologies | A22287 | Use at 1:1000 concentration |
B27 serum-free supplement | Life Technologies | 17504044 | Stock concentration 50x, final concentration 1x |
BMP-4 recombinant human protein | R&D | PHC9534 | Stock concentration 10 μg/mL, final concentration 10 ng/mL |
Cell recovery solution (cell lifting solution) | BD | 354253 | |
CHIR99021 | Abcam | ab120890-5mg | Stock concentration 3 mM, final concentration 3 µM |
Collagenase, type IV powder | Life Technologies | 17104019 | Reconstitute at 0.1% |
Corning cryogenic vials | Corning | 430487 | |
Costar TC treated 24 well culture plates | Corning | CLS3527 | |
DAPI dilactate | Sigma-Aldrich | D9564-10MG | Use at 10 nM concentration |
Dulbecco’s PBS (No MgCl2 or CaCl2) | Life Technologies | 14190-144 | |
Dulbecco’s PBS (with MgCl2 and CaCl2) | Sigma-Aldrich | D8662-100ML | |
Epidermal growth factor | R&D | 236-EG-200 | Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL |
Eppendorf TransferMan NK2 (microinjection system) | Eppendorf | 920000011 | |
Eppendorf Femtojet express (microinjection system) | Eppendorf | 5248 000.017 | |
Essential 8 Flex medium kit (stem cell culture medium) | Life Technologies | A2858501 | |
EVOS XL imaging system (in-hood imaging system) | |||
Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1272-10ML | Stock concentration 10 mg/mL, final concentration 0.1 mg/mL |
Goat anti-Salmonella, CSA-1 | Insight Biotechnology | 02-91-99 | Use at 1:20 concentration |
HEPES 1 M | Life Technologies | 15630056 | |
KnockOut Serum Replacement (setrum replacment) | Gibco | 10828010 | |
GlutaMAX supplement (glutamine supplement | ThermoFisher | ||
L-glutamine | Life Technologies | A2916801 | Stock concentration 200 mM, final concentration 2 mM |
LY294002 | Promega UK | V1201 | Stock concentration 50 mM, final concentration 10μM |
Matrigel, GFR, phenol free (basement membrane matrix) | Corning | 356231 | |
MEM non-essential amino acids solution (100x) | Gibco | 11140035 | |
N2 serum-free supplement | Life Technologies | 17502048 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140163 | Stock concentration 10,000 U/mL, final concentration 100 U/mL |
Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
Piezo Drill Tip Mouse ICSI, 25° tip angle, 6 µm inner diameter | Eppendorf | 5195000087 | |
Prostaglandin E2 | Sigma | P0409-1MG | Stock concentration 2.5 mM, final concentration 2.5 mM |
Recombinant human FGF basic | R&D | 233-FB-025 | Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL |
Recombinant human IL-22 | R&D | 6057-NG-100 | Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL |
Recombinant human Noggin | R&D | 6057-NG-100 | Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL |
Recombinant human R-spondin1 | R&D | 4645-RS-025 | Stock concentration 25 mg/mL, final concentration 500 ng/mL |
Recombinant human/mouse/rat Activin A | R&D | 338-AC-050 | Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL |
Recovery cell culture freezing medium (cell freezing medium) | Gibco | 12648010 | |
Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-50MG | Stock concentration 3μM, final concentration 3mM |
RPMI 1640 media with Glutamax supplement (RPMI Medium with L-glutamine supplement) | Life Technologies | 61870010 | |
Triton X-100 (cell lysis buffer) | Sigma-Aldrich | RES9690T-A101X | Use at 1% concentration |
Versene (EDTA solution) | Life Technologies | 15040066 | |
Vitronectin XF | Stemcell Technologies | 7180 | |
Y-27632 dihydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG | Stock concentration 3 mM, final concentration 10 mM |