Human inducerade pluripotenta stamceller (hiPSC)-härledda intestinala organoider erbjuder spännande möjligheter att modellera enteriska sjukdomar in vitro. Vi visar differentiering av hiPSCs i intestinal organoider (iHOs), stimulering av dessa iHOs med cytokiner, och mikroinjektion av salmonella typhimurium i iho lumen, möjliggör studiet av en epitelial invasion av denna Patogen.
Den intestinala “organoid” (iHO) system, där 3-D strukturer representativa för epitelial slem hinnan i den mänskliga tarmen kan framställas från mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) och upprätthålls i kulturen, ger en spännande möjlighet att under lätta av epitelial respons på enteriska infektioner. In vivo, intestinal epitelceller (IECs) spelar en viktig roll i regleringen av intestinal homeostas och kan direkt hämma patogener, även om de mekanismer som detta sker inte är helt klarlagd. Den cytokin interleukin-22 (Il-22) har visat sig spela en roll i upprätthållandet och försvaret av tarmen epitelial barriär, inklusive inducera en frisättning av antimikrobiella peptider och chemokiner som svar på infektion.
Vi beskriver differentiering av friska kontroll hiPSCs i iHOs via tillsats av specifika cytokin kombinationer till deras odlings substrat innan bädda in dem i en källare membran Matrix-baserade prointestinal kultur system. När inbäddade, den iHOs odlas i media kompletteras med noggin, R-spondin-1, Epidermal tillväxtfaktor (EGF), CHIR99021, prostaglandin E2, och Y-27632 dihydroklorid monohydrat. Veckovis passager av manuella störningar i iHO ultrastruktur leda till bildandet av spirade iHOs, med vissa uppvisar en krypta/villus struktur. Alla iHOs Visa ett differentierat epitel bestående av bägare celler, enteroendokrina celler, Paneth celler, och polariserade enterocyter, som kan bekräftas via immunofärgning för specifika markörer för varje cell delmängd, transmission elektronmikroskopi (TEM) och kvantitativ PCR (qPCR). För att modellera infektion, salmonella enterica serovar TYPHIMURIUM SL1344 är microinjected in i lumen av ihos och inkuberas för 90 min vid 37 ° c, och en modifierad gentamicin skydds analys utförs för att identifiera nivåerna av intracellulära bakterie invasion. Vissa iHOs är också förbehandlade med rekombinant humant IL-22 (rhIL-22) före infektion för att fastställa om detta cytokin är skyddande mot salmonella infektion.
Under de senaste åren, studiet av Host-patogen interaktioner har förbättrats genom utvecklingen av “organoid” modeller, vari 3-D representationer av intestinal epitel kan framställas från olika stamceller. “Primära” organoider kan genereras direkt från intestinala stamceller som skördas från intestinal biopsier. Dessutom kan intestinal organoider genereras från hiPSCs. Samma kan sägas om många vävnader, med gastric1, lever2, bukspottskörteln3,4, hjärnan5,6, lung7, och prostata8 organoider som används av många forskare för att modellera Sjukdom. Det finns många spännande tillämpningar av organoid-systemet, inklusive modellering cancer9 och drog screening10, men här fokuserar vi på användningen av ihos som en infektions modell, med hjälp av S. enterica serovar typhimurium (S. Typhimurium) som en exemplarisk patogen och förbehandling med IL-22 som en terapi.
I denna studie, den hiPSCs som används för att generera iHO är “Kolf2” iPSCs, genereras från en frisk individ och tillgänglig från den mänskliga inducerad Pluripotent Stem Cells initiativ Consortium (HipSci; www.hipsci.org), en öppen till gång referens panel av kännetecknas hiPSC-linjerna11. En fördel med att använda hiPSCs som progenitorer för organoider är att det nu finns omfattande banker av friska givare iPSC linjer tillgängliga, vilket innebär att resultaten kan val IDE ras i ett antal cellinjer med olika genetiska bakgrunder. Dessutom, om forskarna vill titta på specifika sjukdomsassocierade enstaka nukleotid polymorfismer (SNP), är det möjligt att använda CRISPR/Cas9 att iscensätta mutationer i en hälsosam cellinjen, vilket ger både en mutant linje och behålla den isogena kontroll ledning för jämförelse12. Enligt vår erfarenhet är hipsc-härledda intestinal organoider större i storlek än sina primära motsvarigheter och mer konsekvent i kulturen, vilket gör för en mindre tekniskt utmanande Mikroskop och potentiellt tillåta ett mer varierat spektrum av patogener som ska Studerade. iHOs kan vara krygeniskt bevaras, och vi har propagerat iHO kulturer för upp till ett år att producera material för experiment.
In vivo, IECs spelar en viktig roll i regleringen av intestinal homeostas och kan direkt hämma patogener, även om de mekanismer som detta sker inte är väl förstått. Den cytokin Il-22 är känd för att ha en roll i upprätthållandet av tarmen epitelial barriär13 och är involverad i induktion och utsöndring av antimikrobiella peptider och chemokiner som svar på infektion14. Det produceras av aktiverade T-celler (särskilt Th17 celler) samt av naturliga Killer (nk) celler och binder till en heterodimeriskt receptor som består av Il-22r1 och Il-10r2 subenheter15. Receptorn för IL-22 uttrycks basalt på IECs, vilket innebär att i iHO-modellen är det möjligt att förbehandla organoider med rhIL-22 helt enkelt genom sitt tillägg till kultur medium16. En nackdel med det organoid systemet är att det saknar tillhör ande immun svar normalt levereras av andra immun celler typer; emellertid, modeller växer fram som försöker coculture organoider med intestinala lymfocyter för att bättre representera detta17,18.
Användningen av Mikroskop systemet är nyckeln till att simulera infektioner i iho modellen, eftersom detta möjliggör direkt leverans av patogener till apikala ytan av epitelet, som skulle inträffa i fallet med in vivo infektion. Tillsatsen av fenol röd till bakteriell lösning injiceras i iHO markerar de som har smittats, därmed undvika upprepade injektioner av samma iHO. Organoider som fartyg för infektions modellering växer i användning, med patogener såsom Helicobacter pylori,19 den Norovirus,20 rot AVI Rus,21 Shiga toxin-producerande Escherichia coli22, Cryptosporidium23, och Zika virus24 har visat sig överleva och replikera inom dessa system. Denna teknik skulle kunna tillämpas på ett bredare spektrum av patogener, särskilt till organismer som är svåra att odla, såsom protozoer, eller mänskliga begränsade patogener, för att få direkt information om det mänskliga epiteliala svaret på infektionen.
Detta protokoll beskriver differentiering av hiPSCs i iHOs och deras nytta som en modell för att simulera enteriska infektioner. Nedan beskriver vi de kritiska stegen i protokollet och eventuella modifieringar eller förbättringar som vi har gjort.
Detta protokoll effektiviserar differentierings processen för hiPSCs jämfört med tidigare publicerat arbete25. Tidigare använda metoder krävde överföring av hiPSCs från andra hiPSC kultur system (t. ex. feeder-beroende hiPSC kultur) till kemiskt definierade medium-polyvinylalkohol (CDM-PVA). Denna överföring till CDM-PVA tar vanligt vis 2 – 3 veckor och kräver daglig utfodring av hiPSCs. Detta protokoll var inte heller konsekvent effektivt, och vissa differentieringar misslyckades. Därför har vi trialed differentiering med samma tillväxtfaktorer men börjar med hiPSCs odlas i stamceller odlings substrat (snarare än CDM-PVA) och utbyte av CDM-PVA med stamceller odlings substrat under differentiering dagar 0 – 3. Detta har varit framgångs rikt för de fem oberoende hiPSC linjer trialed hittills, vilket gör differentierings processen mycket snabbare och effektivare. Detta gör också helg-fri odling av hiPSCs före differentiering, vilket möjliggör mer flexibilitet i hiPSC kulturen. iHO linjer som produceras av denna metod har fenotypats för markörer för intestinal epitel som vi tidigare har beskrivit för hiPSC linjerna Kolf2, Yemz1, och Lise116 och visas fenotypiskt omöjlig att skilja från ihos produceras med hjälp av tidigare Protokollet.
Efter seedning, iHOs kräver minst 1 månad av rutinmässig passaging, med uppdelning var 4 – 7 dagar för att under lätta mognad. Observera att det kommer att finnas en viss variation i iHO utveckling beroende på iPSC linje som används och tätheten av den ursprungliga kulturen. Under de första avsnitten, kommer det att finnas synligt kontaminerande celler som inte är iHOs. Dessa kommer så småningom att dö, lämnar en ren kultur av sfäriska och efter cirka 4 veckor, spirade iHOs. Dessutom kan ett in-Hood bild system användas för att välja och passage endast iHOs med önskad morfologi. Som iHOs mogna, de kommer att kräva uppdelning var 6 – 7 dagar, beroende på tillväxt takten och densitet. Om något av följande inträffar, iHOs bör delas före denna punkt: den Luminal kaviteter av iHOs börjar att fylla upp med döda celler, källaren membran matris börjar upplösas, den iHOs börja växa ur källaren membran matris, eller kulturen är för tät och mediet börjar gå gult mycket snabbt.
När iHO kulturen är etablerad, om när som helst utseendet på iHOs förändringar eller är annorlunda än väntat (till exempel, kulturerna förblir sfäriska, snarare än spirande), fenotypning via immunhistokemi och qPCR för cell markörer bör vara upprepas för att säkerställa att differentieringen av cell typerna inom iHOs (t. ex. bägare celler, Paneth celler) förblir intakt. Om iHOs inte längre differentierar, då de bör kasseras och redifferentiated eller en tidigare passage av iHOs bör Tinas och rekonstitueras. Om iHOs upphöra att differentiera, de potentiella orsakerna är ålder av kulturen (om det är över 6 månader gamla), aktiviteten av tillväxtfaktorerna (se till att dessa rekonstitueras enligt tillverkarens instruktioner och hålls frysta i små Ali kvoter för att undvika flera frys-tö cykler), alltför frekventa eller våldsamma passager (i allmänhet, passaging bör endast ske en gång i veckan, och om iHOs är manuellt separerade alltför kraftigt på en regelbunden basis, kommer de att upphöra att helt differentiera).
Vi etablerade via RNA-sekvensering som Il-22 stimulering 18 h före infektion uppreglerar antimikrobiella gener och de som är inblandade i barriären försvar fenotyp. Innan användning av nya iHsO för analyser som involverar prestimulering med rhIL-22 (eller en alternativ cytokin om systemet används för detta), är det tillrådligt att kontrol lera aktiviteten av gener som är kända för att vara uppreglerad av cytokin (i fallet med IL-22 , vi använde DUOX2 och LCN2) via QPCR efter stimulering av ihos, för att säkerställa receptor uttryck och intakt signalering. Före den första användningen av IL-22, vi också genomfört immunhistokemi att lokalisera IL-22-receptorn på iHOs att fastställa att uttrycket av IL-22 receptorn var basal, vilket innebär att prestimulering kan uppnås genom att lägga rhIL-22 till iHO kulturen Medium. Men om en receptor är apically uttryckt, kan detta protokoll måste anpassas för att leverera ligander apically.
Fall gro par avseende mikroinjektions systemet är i allmänhet relaterade till delikatess av de nålar som krävs för injektionen. Här använder vi kommersiellt tillgängliga borr spetsar med 6 μm lumen. Det är möjligt att dra injektionsnålar från kapillärer i glas26 även om detta kan vara mindre enhetliga, vilket leder till läckage från nålspetsen eller inkonsekvent volymer injiceras i ihos. Det är viktigt att vara säker på att injektionen har ägt rum i iHO lumen, vilket är en orsak till användningen av fenol röd som ett färg ämne; den iHOs kommer synligt expandera och hålla den röda inoculum, vilket gör att säkerhet om vilka iHOs har injicerats. Ibland nålar kommer att täppa med skräp från iHO väggen; om så är fallet, ta bort nålspetsen inifrån iho och tryck på Clean -knappen på Mikroskop systemet. Detta kommer att producera en kort period av högre luft tryck som bör rensa blockeringen. Det kommer också att framkalla ett läckage av bakterien inokulatet på plattan; Därför, om detta inträffar, bör den rena åtgärden upprepas på alla plattor för att säkerställa lika behandling av bakteriefinoculum per platta. En stor fördel med hiPSC-derived iHOs är deras storlek. Intestinal organoider från möss och primära mänskliga organoider är mycket mindre (mätning upp till ~ 100 μm och 100-300 μm, respektive27, jämfört med 250-1500 μm för hipsc-derived ihos), vilket innebär att injektioner av stora mängder organoider kommer att bli långsammare. Detta gör att större skala injektion experiment som skall trialed i hiPSC-derived iHOs. Det är också möjligt att studera Luminal innehållet i iHOs genom skörd dem post infektion och manuellt dissociera iHOs i DPBS, släppa deras Luminal innehåll. För mikroinjektion, rekommenderar vi att du använder en hög koncentration av bakterier. Vi konstaterade att lägre koncentrationer inte var tillräckliga för att generera ett svar från IECs bestående av iHOs. Dessutom var det svårt att senare lokalisera internaliserade bakterier med hjälp av mikroskopi. Inoculums kan behöva optimeras för olika bakterie stammar.
Sammanfattnings vis, hiPSC-derived iHOs ge en lovande modell för direkt dissekera epitelial svar på enteriska infektioner, antingen genom att studera intracellulära invasion räknas, avbildning, mäta cytokin nivåer i iHO supernatanter, eller skörd RNA till transkriptionella förändringar efter exponering för patogener. Deras nytta kommer att bli ännu tydligare i framtiden för att fastställa infektions modeller för människo-begränsade patogener och för att utnyttja möjligheterna att använda denna teknik för att anpassa forskningen genom att studera specifika sjukdomsrelaterade genetiska mutationer och drog svar.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av finansiering från The Wellcome Trust, The Gates Foundation, och Cambridge biomedicinska forsknings centret. E.A.L. är en klinisk doktorand som stöds av Wellcome Trust.
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-10ML | |
5 mm glass bottom injection dishes | MatTek corporation | P50G-0-14-F | |
Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634010 | |
Alexa fluor 647 phalloidin | Life Technologies | A22287 | Use at 1:1000 concentration |
B27 serum-free supplement | Life Technologies | 17504044 | Stock concentration 50x, final concentration 1x |
BMP-4 recombinant human protein | R&D | PHC9534 | Stock concentration 10 μg/mL, final concentration 10 ng/mL |
Cell recovery solution (cell lifting solution) | BD | 354253 | |
CHIR99021 | Abcam | ab120890-5mg | Stock concentration 3 mM, final concentration 3 µM |
Collagenase, type IV powder | Life Technologies | 17104019 | Reconstitute at 0.1% |
Corning cryogenic vials | Corning | 430487 | |
Costar TC treated 24 well culture plates | Corning | CLS3527 | |
DAPI dilactate | Sigma-Aldrich | D9564-10MG | Use at 10 nM concentration |
Dulbecco’s PBS (No MgCl2 or CaCl2) | Life Technologies | 14190-144 | |
Dulbecco’s PBS (with MgCl2 and CaCl2) | Sigma-Aldrich | D8662-100ML | |
Epidermal growth factor | R&D | 236-EG-200 | Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL |
Eppendorf TransferMan NK2 (microinjection system) | Eppendorf | 920000011 | |
Eppendorf Femtojet express (microinjection system) | Eppendorf | 5248 000.017 | |
Essential 8 Flex medium kit (stem cell culture medium) | Life Technologies | A2858501 | |
EVOS XL imaging system (in-hood imaging system) | |||
Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1272-10ML | Stock concentration 10 mg/mL, final concentration 0.1 mg/mL |
Goat anti-Salmonella, CSA-1 | Insight Biotechnology | 02-91-99 | Use at 1:20 concentration |
HEPES 1 M | Life Technologies | 15630056 | |
KnockOut Serum Replacement (setrum replacment) | Gibco | 10828010 | |
GlutaMAX supplement (glutamine supplement | ThermoFisher | ||
L-glutamine | Life Technologies | A2916801 | Stock concentration 200 mM, final concentration 2 mM |
LY294002 | Promega UK | V1201 | Stock concentration 50 mM, final concentration 10μM |
Matrigel, GFR, phenol free (basement membrane matrix) | Corning | 356231 | |
MEM non-essential amino acids solution (100x) | Gibco | 11140035 | |
N2 serum-free supplement | Life Technologies | 17502048 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140163 | Stock concentration 10,000 U/mL, final concentration 100 U/mL |
Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
Piezo Drill Tip Mouse ICSI, 25° tip angle, 6 µm inner diameter | Eppendorf | 5195000087 | |
Prostaglandin E2 | Sigma | P0409-1MG | Stock concentration 2.5 mM, final concentration 2.5 mM |
Recombinant human FGF basic | R&D | 233-FB-025 | Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL |
Recombinant human IL-22 | R&D | 6057-NG-100 | Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL |
Recombinant human Noggin | R&D | 6057-NG-100 | Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL |
Recombinant human R-spondin1 | R&D | 4645-RS-025 | Stock concentration 25 mg/mL, final concentration 500 ng/mL |
Recombinant human/mouse/rat Activin A | R&D | 338-AC-050 | Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL |
Recovery cell culture freezing medium (cell freezing medium) | Gibco | 12648010 | |
Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-50MG | Stock concentration 3μM, final concentration 3mM |
RPMI 1640 media with Glutamax supplement (RPMI Medium with L-glutamine supplement) | Life Technologies | 61870010 | |
Triton X-100 (cell lysis buffer) | Sigma-Aldrich | RES9690T-A101X | Use at 1% concentration |
Versene (EDTA solution) | Life Technologies | 15040066 | |
Vitronectin XF | Stemcell Technologies | 7180 | |
Y-27632 dihydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG | Stock concentration 3 mM, final concentration 10 mM |