هنا، نقدم بروتوكول اجمع بكفاءة بين وجه كتلة تسلسلية ومركزة شعاع الأيون المسح المجهري الإلكترون لاستهداف منطقة ذات أهمية. يسمح هذا للبحث الفعال، في ثلاثة أبعاد، وتحديد موقع الأحداث النادرة في مجال عرض كبير.
يسمح هذا البروتوكول بالتصوير الفعال والفعال لعينات الخلايا أو الأنسجة في ثلاثة أبعاد على مستوى القرار من الفحص المجهري الإلكتروني. لسنوات عديدة ظلت المجهر الإلكتروني (EM) تقنية ثنائية الأبعاد بطبيعتها. مع ظهور تقنيات التصوير بالمجهر الإلكتروني المسح التسلسلي (حجم EM)، باستخدام إما ميكروتومي متكامل أو شعاع أيون مركز لشريحة ثم عرض الأنسجة المضمنة، يصبح البعد الثالث يمكن الوصول إليها بسهولة. يستخدم الفحص المجهري للإلكترون (SBF-SEM) المسح المجهري للوجه من البلوك التسلسلي ميكروميكروتومي مغلق ًا في غرفة SEM. لديها القدرة على التعامل مع عينات كبيرة (1000 ميكرومتر × 1000 درجة مئوية) وحقول كبيرة للصورة في حجم صغير X، Y بكسل، ولكن محدودة في البعد Z بواسطة سكين الماس. لا يقتصر التركيز على شعاع أيون SEM (FIB-SEM) في القرار 3D، (voxels متساوي المدار من ≤ 5 نانومتر قابلة للتحقيق)، ولكن مجال الرؤية هو أكثر محدودية بكثير. يوضح هذا البروتوكول سير عمل للجمع بين التقنيتين للسماح بالعثور على مناطق فردية ذات أهمية (ROIs) في حقل كبير ثم تصوير المجلد المستهدف اللاحق بدقة فوكسل عالية النظائر. إعداد الخلايا الثابتة أو الأنسجة هو أكثر تطلبا لتقنيات EM حجم بسبب المتناقضة اضافية اللازمة لتوليد إشارة فعالة في التصوير SEM. وتستغرق هذه البروتوكولات وقتا طويلا وكثيفة العمالة. ويتضمن هذا البروتوكول أيضا معالجة الأنسجة بمساعدة الموجات الدقيقة التي تيسر اختراق الكواشف، مما يقلل من الوقت اللازم لبروتوكول المعالجة من أيام إلى ساعات.
يصف هذا البروتوكول سير عمل للاستهداف الفعال للميكروسكوب الإلكتروني ثلاثي الأبعاد عالي الدقة (EM) إلى منطقة معينة ذات أهمية (ROI). منذ بداياتها في الثلاثينات من القرن الماضي، كانت EM تقنية ثنائية الأبعاد في الأساس. كانت الصور المنشورة الأولى من أنسجة أو خلايا كاملة ولكن سرعان ما أفسحت المجال للأقسام التي تم قطعها باليد باستخدام ultramicrotome وصورة باستخدام المجهر الإلكتروني الإرسال (TEM). TEM تنتج ميكروغرافات عالية الدقة جدا حيث حتى أصغر من الهياكل الخلوية يمكن تمييزها بوضوح. ومع ذلك، فإن نحافة القسم اللازم لتصوير الأنسجة بواسطة شعاع الإلكترون جعلت المعلومات في البعد Z الحد الأدنى. وبما أن الخلايا هي هياكل ثلاثية الأبعاد، كان لا بد من الاستدلال على التفاعلات بين هياكل الخلايا وأسطح الخلايا من بيانات محدودة. وقد أثار ذلك احتمال سوء التفسير، لا سيما في الهياكل المعقدة. تمكن بعض microscopists للحصول على هياكل أكثر دقة 3D عن طريق الخلايا التسلسلية والأنسجة ومن ثم إعادة بنائها بشق الأنفس من الصور TEM الفردية1. وكانت هذه عملية كثيفة العمالة جدا وقبل ظهور التصوير الرقمي والكمبيوتر تقديم النتائج كان من الصعب أيضا تصور. في السنوات الأخيرة تم إدخال تقنيتين أصبحتا تعرفان بشكل جماعي باسم مجهري الإلكترون الحجم (حجم EM)2 التي جعلت EM في ثلاثة أبعاد في متناول المزيد من المختبرات.
فكرة الحصول على كومة من الصور من كتلة جزءا لا يتجزأ من داخل المجهر الإلكتروني يمكن إرجاعها إلى عام 1981 عندما ستيف ليتون وألان Kuzirian بنيت ميكروتومي مصغرة ووضعها في غرفة المجهر الإلكتروني المسح3 (SBF-SEM) . تم نسخ هذا النموذج الأولي في نهاية المطاف وتحسينه بعد 23 عاما من قبل دينك وهورستمان4 وتسويقها في وقت لاحق. في نفس الوقت تقريبا أصبح العلماء البيولوجيون على بينة من تكنولوجيا أخرى تستخدم في المقام الأول في علوم المواد، وشعاع أيون مركزة. تستخدم هذه التقنية شعاع أيون من نوع ما (الغاليوم، البلازما) لإزالة كمية صغيرة جدا من المواد السطحية من عينة (FIB-SEM)5. كلا الأسلوبين تستخدم المقاطع تليها التصوير توفير سلسلة من الصور التي يمكن دمجها في X، Y، Z، كومة. توفر كلتا التقنيات معلومات ثلاثية الدقة ولكن بمقاييس دقة مختلفة. SBF-SEM محدودة بالخصائص الفيزيائية للسكين الماس إلى شرائح لا أرق من 50 نانومتر لأشواط التصوير التسلسلي الطويل; ومع ذلك فإن حجم كتلة العينة التي يمكن تقسيمها كبير، ويصل إلى 1 مم × 1 مم × 1 مم. ، يمكن أن تكون أحجام بكسل الصورة صغيرة مثل 1 نانومتر. وهذا يؤدي إلى voxels غير متساوي المدار حيث البعد X,Y غالباً ما يكون أصغر من Z. بسبب دقة شعاع أيون، FIB-SEM لديه القدرة على جمع الصور مع voxels متساوي المدار ≤ 5 نانومتر. ومع ذلك، فإن المساحة الإجمالية التي يمكن تصويرها صغيرة جداً. وقد تم نشر جدول موجز لمختلف العينات والمجلدات المصورة مع التقنيات اثنين سابقا3.
إعداد الأنسجة لحجم EM هو أكثر صعوبة من TEM القياسية أو SEM لأن العينات يجب أن تكون ملطخة لتوفير توليد إشارة كافية في SEM. في كثير من الأحيان، البقع تحتاج إلى تحسين ليس فقط لنوع الأنسجة معينة ولكن أيضا لإضافة على النقيض من بعض الهياكل الخلوية لجعل تحديد وإعادة الإعمار أسهل. ويستند البروتوكول المستخدم هنا على معيار NCMIR6. تلطيخ إضافية عادة ما يعني خطوات بروتوكول إضافية. وبالتالي بالنسبة لحجم EM، يلزم تمديد البروتوكولات القياسية لضمان الوقت الكافي للكواشف لاختراق العينة. يمكن للمعالجة بمساعدة الميكروويف تقليل الوقت اللازم للتلطيخ من ساعاتإلى دقائق ويجعل حجم EM إعداد عينة أكثر كفاءة 7. هذه الطريقة تنطبق على جميع أنواع الخلايا والأنسجة8 وعلى أسئلة البحث حيث عدم تجانس الأنسجة يجعل أخذ العينات من منطقة محددة ضرورية9.
بمجرد الحصول على مكدس بيانات يمكن محاذاته وتجزئة بنيات الاهتمام من بقية البيانات ونمذجتها في 3D. على الرغم من أن أتمتة التصوير العديد من شرائح الأنسجة جعلت الحصول على صورة مباشرة نسبيا، فإن عملية إعادة بناء البيانات وتصورها رقميا ً مهمة تستغرق وقتاً طويلاً. ولم تُدمج بعد البرمجيات لهذا الغرض ولا تكون آلية بالكامل. منذ الكثير من العمل في وقت مبكر باستخدام حجم EM كان موجها نحو علم الأعصاب، وتقنيات تلطيخ والرقمية هياكل التجزئة مثل المحاور متقدمة إلى حد ما بالمقارنة مع الخلايا الأخرى والعضيات. في حين أن الأدب على الأنسجة الأخرى غير العصبية ينمو بسرعة, هياكل غير خطية أو غير منتظمة تتطلب المزيد من المدخلات اليدوية.
استخدام كل من SBF-SEM و FIB-SEM هو نهج مفيد لاستهداف وتصوير هياكل الأنسجة محددة وغير متجانسة في دقة عالية في 3D. الجمع بين ذلك مع معالجة الأنسجة بالموجات الدقيقة بمساعدة أن يقلل إلى حد كبير من الوقت اللازم لإعداد العينة. معا هذا سير العمل سيجعل توليد عالية الدقة isotropic voxel مجموعات البيانات صورة من الهياكل الدقيقة عملية فعالة وأكثر سرعة.
حجم الإلكترون المجهري هو أكثر تحديا وتستغرق وقتا طويلا من SEM التقليدية أو TEM. بسبب الحاجة إلى وصمة عار الأنسجة أو الخلايا في كتلة، يجب أن تكون خطوات المعالجة طويلة بما فيه الكفاية لضمان اختراق الكواشف في جميع أنحاء العينة. استخدام طاقة الميكروويف لتسهيل الاختراق يجعل معالجة أقصر وأكثر كفاءة ويحسن تلطيخ. لأن التحضير لEM هو أكثر صرامة بكثير من للميكروسكوب الخفيفة يجب أن تكون جميع الحلول والكواشف رقابة الجودة بدقة. يمكن أن يكون للتغيرات في الحموضة، والتوتر، واستخدام الكواشف غير النقية، وإدخال الملوثات بسبب ضعف التقنية، جميعها آثار ضارة على الصورة النهائية.
يتطلب حجم EM أيضابروتوكولات مصممة بشكل فردي لكل نوع عينة مختلفة. الأنسجة الثدييات من أنواع مختلفة: النباتات، والخلايا واحدة مثل الخميرة، trypanosomes، C. elegans،وما إلى ذلك، كل حاجة الاختلافات الخاصة بهم لتحقيق النتائج المثلى. يجب تصميم التثبيت وتلطيخ من أجل الحفاظ على السلامة الهيكلية والحفاظ على العينة أقرب إلى مورفولوجيا في الجسم الحي قدر الإمكان. تثبيت الأنسجة في درجة الحرارة الفسيولوجية، ودرجة الحموضة وتونية أمر بالغ الأهمية لجعل العينة مثل الحياة كما يمكن أن يكون. تجميد الضغط العالي (HPF) من العينات قد يساعد على الحفاظ على حالة أكثر تشبه الحياة، (أو ربما مجرد إنتاج قطع أثرية مختلفة)، ولكن بالنسبة لغير الخلايا والأنسجة رقيقة جدا سوف تفشل HPF كما الجليد الزجاجي لا يمكن أن تولد إلا في كميات صغيرة. لذلك لكثير من الأسئلة التثبيت الكيميائي هو الخيار الوحيد. بغض النظر عما إذا كان التثبيت هو HPF أو الكيميائية، في أي تجربة EM النتائج الهيكلية تحتاج إلى أن تكون مقارنة بعناية إلى نتائج مماثلة من الخلايا الحية أو تصوير الأنسجة لمعرفة ما إذا كانت متسقة. يجب أيضا أن يكون الأمثل تلطيخ مع النظر في السؤال المحدد الذي يحتاج إلى الإجابة والبروتوكول الذي سيتم استخدامه لتصور الصور الرقمية.
وجود كل من SBF-SEM ونظام FIB على مقربة من ذلك هو ميزة كبيرة في العديد من التجارب. مجال الرؤية الكبير وارتفاع X،Y القرار من SBF-SEM يجعل العثور على الهياكل الفردية / الخلايا / الأحداث مباشرة ويوفر التوجه المكاني العام للخلايا في الأنسجة. وبالإضافة إلى ذلك، قدرتهعلى السماح التصوير من خلال عينة في Z قوية جدا. ومع ذلك، يمكن أن تفشل عمليات إعادة الإعمار التي تتطلب تفاصيل هندسية دقيقة أو تنتج قطع أثرية باستخدام هذه التقنية بسبب voxels غير متساوي المدار الذي يولده. يقتصر FIB من قبل الفيزياء من العملية إلى مجال التصوير أصغر ولكن قرارها 3D كافية لإعادة الإعمار دقيقة جدا. الجمع بين التقنيات اثنين هو واضح كما يمكن أن تنتقل العينات من SBF-SEM إلى FIB دون مزيد من المعالجة أو التحضير. ونحن نعترف بأن استخدام SBF-SEM للبحث من خلال عينة للعثور على منطقة معينة هو استخدام مكلفة جدا من أداة أكثر قدرة. ومع ذلك، فإن القدرة على رؤية الوجه الجديد على الفور وتحديد ما إذا كان قد تم الوصول إلى عائد الاستثمار هو ميزة كبيرة. بالإضافة إلى ذلك، قد تؤدي بدائل استخدام المقاطع المتوسطة الحجم نصف الرقيقة التسلسلية (0.5 م) إلى إزالة الهياكل الصغيرة قبل اكتشافها، وفحص كتلة باستخدام مقاطع TEM واحدة يجب قطعها، ووضعها على شبكة ثم عرضها في TEM مكلفة بنفس القدر ليس كما هو الحال في كفاءة الطريقة المعروضة.
نظرًا لوجود العديد من البرامج لتجزئة البيانات وتقديمها، وقد لا يتم تقديم احتياجات بنية معينة بشكل أفضل بواسطة تطبيق واحد، لا يمكن اقتراح سير عمل قياسي. قد يتم تقسيم بعض الهياكل البسيطة مع خوارزمية عتبة إذا كانت تقع ضمن قيم مقياس رمادي ضيق جداً. يمكن تقسيم الهياكل العصبية شبه تلقائيا باستخدام برنامج مثل Ilastik11 ولكن سيكون أقل فائدة على العضيات على شكل أكثر عشوائية أو معقدة مثل ER. مصفحات متصفح الصور هو برنامج مرن جدا التي يمكن محاذاة، قطعة، وتقديم حجم البيانات EM، ولكن يتطلب تفاعل كبير من قبل المستخدم12. وكقاعدة عامة، فإن مقدار الوقت اللازم لتصور النتائج رقمياً سيتجاوز إلى حد كبير الوقت المخصص لإعداد العينة والتصوير.
وقد فتحت تقنيات حجم EM البعد الثالث للتحليل الهيكلي الفائق. طرق أخرى للحصول على EM 3D لها قيود في حجمها (التصوير المقطعي TEM)، أو كفاءتها (القسم التسلسلي TEM). وعلى الرغم من أن معظم التقنيات في مجال الاستجابة للعينات الحجم معقدة للغاية ومكلفة بحيث لا يمكن تنفيذها في فرادى المختبرات، فإن عدد المرافق الأساسية المشتركة التي تقدمها آخذ في الازدياد، كما أن عدد أنواع العينات التي تم تصويرها بنجاح قد ازداد بسرعة. بالنسبة لأولئك الذين لديهم سؤال معين ونسيج معين فمن المرجح أن يكون شخص ما قادرا على تقديم المشورة والتعليمات بشأن إعداده والتصوير. يمكن تحسين حجم معدات EM لتشمل القدرة على التعامل مع عينات أكبر في SBF-SEM والقدرة على طحن أكبر ROIs مع FIB. والبرمجيات القادرة على تقسيم الهياكل ذات الأهمية بطريقة أكثر آلية ستبسط إلى حد كبير عملية تحليل البيانات والتحسينات في سرعة الحوسبة، وتقلل من الوقت اللازم للقيام بذلك. على الرغم من القيود الحالية، حجم EM لا يزال أداة مفيدة والجمع بين SBF-SEM وFIB-SEM يوفر سير عمل فعال لتحديد الأحداث النادرة وتصويرها بدقة عالية.
The authors have nothing to disclose.
وقد تم توفير معدات الحجم EM بمنحة سخية من حكومة فلاندرز.
3View 2XP | Gatan | NA | In chamber ultramicrotome for SBFI |
Cacodylate buffer 0.2M solution | EM Sciences | 11652 | |
Conductive epoxy resin (circuit works) | RS components | 496-265 | |
Diatome Histo 4.0mm diamond knife | EM Sciences | 40-HIS | |
Digitizing tablet | Wacom | DTV-1200W | No longer available |
Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 120.094 | |
Flat Embedding Mold | EM Sciences | 70900 | |
Gluteraldehyde 25% solution | EM Sciences | 16220 | |
High MW Weight Tannic Acid | EM Sciences | 21700 | |
Lead Citrate | Sigma-Aldrich | 22861 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | 746398 | |
Osmium Tetroxide 4% solution | EM Sciences | 19170 | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
Pelco Biowave Pro + | Ted Pella | 36700 | |
Potassium Ferrocyanide | Sigma-Aldrich | P3289 | |
Quorum Q150T ES sputter coater | Quorum Technologies | 27645 | |
Reichert-Jung Ultracut ultramicrotome | NA | NA | No longer available |
Sodium Cacodylate 0.2M | EM Sciences | 11653 | |
Spurrs Resin kit | EM Sciences | 14300 | |
Uranyl Acetate | EM Sciences | 22400 |