Generación de hidrogeles a base de colágeno 3D para analizar el crecimiento y el comportamiento axonal durante el desarrollo del sistema nervioso
Summary
Aquí, proporcionamos un método para analizar el comportamiento del crecimiento de axons en matrices 3D, imitando su desarrollo natural.
Abstract
Este protocolo utiliza colágeno natural tipo I para generar hidrogel tridimensional (3-D) para monitorear y analizar el crecimiento axonal. El protocolo se centra en el cultivo de pequeños trozos de cerebros de roedores embrionarios o postnatales tempranos dentro de un hidrogel 3D formado por el colágeno tipo I derivado del tendón de la cola de rata con porosidad específica. Las piezas de tejido se cultivan dentro del hidrogel y se enfrentan a fragmentos cerebrales específicos o agregados celulares modificados genéticamente para producir y secretar moléculas adecuadas para crear un gradiente dentro de la matriz porosa. Los pasos de este protocolo son simples y reproducibles, pero incluyen pasos críticos a considerar cuidadosamente durante su desarrollo. Además, el comportamiento de los axons en crecimiento se puede monitorear y analizar directamente utilizando un microscopio de contraste de fase o un microscopio de fluorescencia mono/multifoto después de la fijación mediante métodos inmunocitoquímicos.
Introduction
Los axónicos neuronales, que terminan en conos de crecimiento axonal, migran largas distancias a través de la matriz extracelular (ECM) del embrión sobre vías específicas para alcanzar sus objetivos apropiados. El cono de crecimiento es la porción distal del axón y estáespecializado para detectar el entorno físico y molecular de la célula 1,2. Desde un punto de vista molecular, los conos de crecimiento se guían por al menos cuatro mecanismos moleculares diferentes: atracción de contacto, quimioatracción, repulsión de contacto y quemorepulsión desencadenada por diferentes señales de orientación axonal3,4 , 5 , 6.Los procesos mediados por contacto pueden monitorizarse parcialmente en cultivos bidimensionales (2D) en sustratos micropatrones (por ejemplo, con rayas 7,8 o manchas9 que contengan las moléculas). Sin embargo, los axons pueden navegar a su objetivo de una manera no difusa mediante la sensación de varias moléculas atractivas y repulsivas de las células de la guía en el medio ambiente4,5,10. Aquí, describimos un método fácil de cultivo 3D para comprobar si una molécula secretada induce efectos chemorepulsivas o quimioatractivos en el desarrollo de axones.
Los primeros estudios tenían como objetivo determinar los efectos de las señales de orientación de axón utilizadas en cultivos explantados en matrices tridimensionales (3-D) para generar gradientes que simulaban en condiciones vivas11,12. Este enfoque, junto con los experimentos in vivo, permitió la identificación de cuatro familias principales de señales de orientación: Netrins, Slits, Semaphorins, y Ephrins4,5,6. Estas señales moleculares y otros factores13 están integradas por los axons en crecimiento, desencadenando la dinámica de los complejos de adhesión y transduciendo las fuerzas mecánicas a través del citoesqueleto14,15,16. Para generar gradientes moleculares en cultivos tridimensionales para la navegación axonal, investigadores pioneros utilizaron sustratos de coágulos plasmáticos17,que también se utilizaron para preparaciones de rodajas organotípicas18. Sin embargo, en 1958, se informó de un nuevo protocolo para generar hidrogeles de colágeno 3D para estudiar con los dispositivos de Maximow19,una plataforma de cultivo, utilizada en varios estudios adecuados para observaciones microscópicas20. Otro estudio pionero informó el gel de colágeno como una herramienta para incrustar fibroblastos humanos para estudiar la diferenciación de fibroblastos en miofibroblastos en procesos de cicatrización de heridas21. Paralelamente, Lumsden y Davies aplicaron colágeno de la dermis bovina para analizar el efecto putativo del factor de crecimiento nervioso (NGF) en la orientación de las fibras nerviosas sensoriales22. Con el desarrollo de nuevas plataformas de cultivo (por ejemplo, placas multipozos) pordiferentes empresas y laboratorios, los cultivos de colágeno se adaptaron a estos nuevos dispositivos 6,23,24,25 ,26. Paralelamente, un extracto de material ECM derivado de la línea de células tumorales Engelbreth-Holm-Swarm se puso a disposición comercialmente para ampliar estos estudios27.
Recientemente, se han desarrollado varios protocolos para generar gradientes moleculares con funciones putativas en la orientación de axón utilizando hidrogeles 3D (por ejemplo, colágeno, fibrina, etc.) 28. Alternativamente, la molécula candidata puede ser inmovilizada a diferente concentración en una matriz porosa (por ejemplo, NGF29) o generada por el cultivo en una pequeña región de los agregados de células hidrogel 3D que segregan la molécula para generar una gradiente4,23,24,25,26. La última posibilidad se explicará en este protocolo.
El procedimiento presentado aquí es un método fácil, rápido y altamente reproducible basado en el análisis del crecimiento axonal en cultivos de hidrogel 3D del cerebro de ratón embrionario. En comparación con otros métodos, el protocolo es adecuado para investigadores no entrenados y se puede desarrollar completamente después de un breve entrenamiento (1-2 semanas). En este protocolo, primero aislamos el colágeno de las colas de rata adultas para generar matrices tridimensionales en las que los agregados celulares modificados genéticamente se cultivan frente al tejido neuronal embrionario. Estos agregados celulares forman gradientes químicos radiales de una molécula candidata que provoca una respuesta para los axones en crecimiento. Por último, la evaluación de los efectos de la molécula en los axónicos en crecimiento se puede realizar fácilmente mediante una microscopía de contraste de fase o, alternativamente, métodos inmunocitoquímicos.
Protocol
Representative Results
Discussion
El crecimiento de los axons en desarrollo es principalmente invasivo e incluye la degradación y remodelación de ECM. Utilizando el procedimiento presentado aquí, los investigadores pueden obtener una matriz 3D homogénea formada por el colágeno natural tipo I en el que los axons (o células) pueden responder a un gradiente químico secretado por células modificadas genéticamente como lo hacen in vivo. Diferentes respuestas axonales a gradientes de señales atractivas o inhibitorias (proteínas, lípidos, etc.) se p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a Tom Yohannan por el asesoramiento editorial y a M. Segura-Feliu por la asistencia técnica. Este trabajo fue financiado por el Programa CERCA y por la Comisión de Universidades e Investigación del Departamento de Innovación, Universidades y Empresa de la Generalitat de Catalunya (SGR2017-648). Este trabajo fue financiado por el Ministerio de Investigación, Innovación y Universidad de España (MEICO) a través de BFU2015-67777-R y RTI2018-099773-B-100, la Red Española de Morones (Prionet España AGL2017-90665-REDT), y el Instituto Carlos III, CIBERNED ( PRY-2018-2).
Materials
| Material | |||
| 3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets (DAB) | Sigma | D5905 | |
| Adult Sprague-Dawley rats (8 to 9 weeks old) | Criffa-Credo, Lyon, France | ||
| Avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) | Vector Labs | PK-4000 | |
| B27 serum-free supplement 50x | Invitrogen | 17504-044 | |
| Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| cDNA plasmid vectors | |||
| COS1 cell lines | ATTC | CRL-1570 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | 16325 | |
| D-(+)-glucose (45% solution in water) for complete Neurobasal medium | Sigma | G8769 | |
| D-MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium 1x ) for COS1 culture medium | Invitrogen | 41966-029 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline 10x (without Ca2+ and Mg2+) (D-PBS) for cultures | Invitrogen | 14200 | |
| Ethanol | merck | 108543 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid dihydrate disodium salt (EDTA) | Sigma | E5134 | |
| Fluorescence mounting media (e.g., Fluoromount-G or similar) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 17984-25 | |
| Gelatin powder | Sigma | G1890 | |
| Glacial acetic acid (Panreac, cat. no. 211008) | Panreac | 211008 | |
| Hank’s balanced salt solution | Invitrogen | 24020083 | |
| Heat-inactivated foetal bovine serum | Invitrogen | 10108-165 | |
| Heat-inactivated horse serum | Invitrogen | 26050-088 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2, 32 to 33% in water) | Sigma | 316989 | |
| L-glutamine 200 mM solution (100x) for complete Neurobasal and COS1 medium | Invitrogen | 25030-024 | |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Invitrogen | 11668-019 | |
| Mice pregnant female (embryonic day 12.5 to 16.5; E12.5-16.5) | Criffa-Credo, Lyon, France | ||
| Modified Minimum Essential Medium Eagle (MEM) | Invitrogen | 11012-044 | |
| Monoclonal antibody against class III β-tubulin (clone TUJ-1) | Biolegend | 801201 | |
| N-2 supplement 100x | Invitrogen | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 1,040,051,000 | |
| Penicillin/streptomycin solution 100x | Invitrogen | 15140-22 | |
| Phosphate buffered saline 10x (PBS) for immunocytochemistry | Invitrogen | AM9624 | |
| Secondary antibody: biotinylated horse anti-mouse | Vector Labs | BA-2000 | |
| Serum-free medium (Opti-MEM) | Invitrogen | 11058-021 | |
| Sodium azide | Panreac | 162712 | |
| Sodium bicarbonate solution 7.5% | Invitrogen | 25080-094 | |
| Sterile culture grade H2O | Sigma | W3500 | |
| TritonTM X-100 | Sigma | X100 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Trypsin-EDTA (Trypsin (0.05% (wt/vol) with EDTA (1x) | Invitrogen | 25300-054 | |
| Equipment | |||
| 1 large and 1 small curved scissors for dissection | Fine tools Instruments or similar | ||
| 1.5-ml conical centrifuge tubes | Eppendorf or similar | ||
| 15-ml conical centrifuge tubes | Corning or similar | ||
| 2 haemostats | Fine tools Instruments or similar | ||
| 2 small straight dissecting scissors | Fine tools Instruments or similar | ||
| 200-ml centrifuge tubes for centrifugation | Nalgene or similar | ||
| 200-ml sterile glass conical flasks | |||
| 2-litre glass beaker | |||
| 4- and 6-well culture plates | Nunc | 176740 and 140675 | |
| Automatic pipette pumps and disposable 10 ml and 25 ml filter-containing sterile plastic pipettes. | Gilson, Brand, Eppendorf or similar | ||
| Automatic pipettes, sterile filter tips and current sterile tips | Gilson, Eppendorf or similar | ||
| Bench top microcentrifuge with angle fixed rotor | Eppendorf, Beckman Coulter or similar | ||
| Bench top refrigerated centrifuge with swing-bucket rotor (with 1.5, 15 and 50 ml tube adaptors) | Eppendorf, Beckman Coulter or similar | ||
| Cell culture incubator at 37 ºC, 5% CO2 and 95% air | |||
| Dialysis tubing cellulose membrane | Sigma | D9402 | |
| Dialysis tubing closures | Sigma | Z37101-7 | |
| Disposable glass pipettes | |||
| Dissecting microscope with dark field optics | Olympus SZ51 or similar | ||
| High-speed refrigerated Beckman Coulter centrifuge or similar with angle fixed rotor | |||
| Laminar flow hood | |||
| Large 100-mm, 60-mm and small 35-mm Ø cell culture dishes | Nunc | 150679 , 150288 and 150318, respectively | |
| Magnetic stirrer and magnetic spin bars | IKA or similar | ||
| McIlwain tissue chopper | Mickle Laboratory Engineering | ||
| One pair of fine straight forceps and one pair of curved forceps | Fine tools Instruments or similar | ||
| Razor blades for the tissue chopper | |||
| Scalpels (number 15 and 11) | |||
| Two pairs of fine spatulas for transferring collagen and tissue pieces | Fine tools Instruments or similar | ||
References
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