Strålebehandling af Organotypiske kulturer fra Submandibulær og Parotid spytkirtler modeller Key in vivo egenskaber

Summary

Ved hjælp af tre-dimensionelle organotypiske kulturer til at visualisere morfologi og funktionelle markører for spytkirtler kan give nye indblik i mekanismerne for vævsskade efter stråling. Beskrevet her er en protokol til sektion, kultur, irradiat, bejdsen, og billede 50 – 90 μm tykke spytkirtel sektioner før og efter udsættelse for ioniserende stråling.

Abstract

Hyposalivation og xerostomi skaber kroniske orale komplikationer, der mindsker livskvaliteten hos patienter med hoved-og hals kræft, som behandles med strålebehandling. Eksperimentelle tilgange til forståelse mekanismer af spytkirtel dysfunktion og restaurering har fokuseret på in vivo modeller, som er handicappet af en manglende evne til systematisk at screene terapeutiske kandidater og effektivitetsgevinster i transfektering evne til at manipulere specifikke gener. Formålet med denne spytkirtel organotypiske kultur protokol er at evaluere maksimal tid for kulturens levedygtighed og karakterisere cellulære ændringer efter ex vivo strålebehandling. Vi udnyttede immuno fluorescens farvning og confokal mikroskopi til at bestemme, hvornår specifikke cellepopulationer og markører er til stede i løbet af en 30-dages kultur periode. Desuden evalueres celle markører, der tidligere er indberettet i in vivo-strålings modeller, i kulturer, der er bestrålet ex vivo. Bevæger sig fremad, denne metode er en attraktiv platform for hurtig ex vivo vurdering af murine og humane spytkirtel væv svar til terapeutiske midler, der forbedrer spyt funktion.

Introduction

Korrekt spytkirtel funktion er afgørende for oral sundhed og er ændret efter hoved-og hals kræftbehandling med strålebehandling¹. I 2017 blev der rapporteret næsten 50.000 nye tilfælde af hoved-og hals kræft i USA². På grund af de vævsskade lige og ofte uoprettelige virkninger af strålebehandling på omgivende normale væv såsom spytkirtler, patienter er ofte tilbage med alvorlige bivirkninger og forringet livskvalitet^{2,3, 4}. for at Almindelige komplikationer forårsaget af strålingsskader manifesterer sig i symptomer som xerostomi (den subjektive følelse af mundtørhed), tand karies, nedsat evne til at tygge og sluge, taleforstyrrelser og kompromitterede orale mikrobiomer^{2, 3} af ^{, 4}. disse symptomer kollektivt kan føre til underernæring og nedsat overlevelse hos berørte personer⁵. Mens spytkirtel dysfunktion i denne population har været veldokumenteret, er de underliggende mekanismer for skader på acinic celler blevet anfægtet, og der er ringe integration mellem forskellige dyremodeller^6,7.

De nuværende metoder til at studere spytkirtel funktion og stråling-induceret skader omfatter brugen af in vivo modeller, udødeliggjort cellelinjer, to-dimensionelle (2-D) primære cellekulturer og tredimensionale (3-D) salisphere kulturer^{8, 9,10,11,12}. Traditionelt, cellekultur modeller fra udødeliggjort cellelinjer og 2-D kulturer involverer enkeltlags celler dyrket på flade overflader og er værdifulde for hurtige, nemme og omkostningseffektive eksperimenter. Men, kunstige cellekultur betingelser kan ændre differentierings status og fysiologiske reaktioner af celler udsat for forskellige betingelser, og resultaterne ofte undlader at oversætte til hele organismen modeller^14,15. Hertil kommer, udødeliggjort cellekulturer kræver graduering af P53 aktivitet, som er afgørende for spytkirtel respons på DNA-skade^16,17.

3-D salisphere kulturer er beriget for Stam-og progenitorceller på tidlige tidspunkter i kultur og har været nyttige for forståelsen af radio følsomhed af denne delmængde af spytkirtel celler^9,18. En kritisk begrænsning af alle disse kultur modeller er de ineffektive i at visualisere 3-D struktur af spytkirtel, herunder den ekstracellulære matrix (ECM) og celle-celle interaktioner over forskellige lag, som er afgørende i modulende spyt sekretion¹⁵. Behovet for en metode, der omfatter opførsel af vævet som helhed, men kan også manipuleres under laboratoriebetingelser for at studere virkningerne af behandlingen er nødvendig for yderligere at opdage de underliggende mekanismer af stråling-induceret spytkirtel Dysfunktion.

Levende vævs skæring og kultur er blevet dokumenteret tidligere^19,20 og bruges ofte til at studere hjernens-vævs interaktioner²¹. I tidligere studier blev parotideale (par) spytkirtel vævet fra mus opdelt på ca. 50 μm og kultiveret i op til 48 h, og analyse af levedygtighed, celledød og funktion blev udført derefter¹⁹. Su et al. (2016) udvidet på denne metode ved dyrkning af humane submandibulære kirtler (Smg’er) opdelt på 35 μm eller 50 μm i 14 dage²⁰. Den foreslåede metode er en avancement i, at det omfatter både parotitis og submandibulære spytkirtler sekeret på 50 μm og 90 μm og evaluering af kulturerne i 30 dage. Evnen til at skære en række vævs tykkelse er vigtig i vurderingen celle-celle-og celle-ECM interaktioner, der er relevante for cellulære processer, herunder apical-basolaterale polaritet og innervation for sekretion. Desuden blev de spytkirtel skiver bestrålet mens i kulturen for at bestemme gennemførligheden af denne kulturmodel til at studere stråling-induceret spytkirtel skader.

Formålet med denne spytkirtel organotypiske kultur protokol er at evaluere maksimal tid for kulturens levedygtighed og karakterisere cellulære ændringer efter ex vivo strålebehandling. For at bestemme den maksimale tid sektioner, der er levedygtige efter dissektion, trypan blå farvning, levende celle farvning, og immunhistokemiske farvning for celledød blev udført. Confokal mikroskopi og immuno fluorescens farvning blev udnyttet til at evaluere specifikke cellepopulationer, morfologiske strukturer og niveauer af spredning. Væv sektion kulturer blev også udsat for ioniserende stråling til at bestemme virkningerne af stråling på forskellige markører i denne 3-D model. Induktion af celledød, cytoskeletale forstyrrelser, tab af differentierings markører og kompenserende proliferation i bestrålede ex vivo-kulturer blev sammenlignet med tidligere undersøgelser af in vivo-modeller. Denne metode giver et middel til at undersøge den rolle, som celle celle interaktioner efter strålingsskader og giver en eksperimentel model til effektivt at vurdere effekten af terapeutiske interventioner (genmanipulationer eller farmakologiske agenser ), som kan være mindre velegnet til in vivo-modeller.

Protocol

1. fremstilling af vibratome Spray aftagelige komponenter af vibratome herunder buffer bakken, klinge fastgørelse, agopstået blok skimmel, og laboratorie film med 70% ethanol, derefter UV-sterilisere i mindst 30 min. Placer og fastgør et ekstra ark laboratorie film over buffer bakken for at forhindre is i at falde i. Fyld iskammeret med knust is, Fjern laboratorie filmen fra buffer bakken, og fyld buffer bakken med 100 mL iskold 1x fosfat bufferet saltopløsning (PBS), suppleret med 1% pe…

Representative Results

Primær 2-D kulturer dyrkes i føtale kvægserum (FBS) suppleret medier mens primær 3-D salisphere kultur er typisk dyrkes i serum-fri betingelser10,11. Desuden har de to tidligere undersøgelser, der udnytter vibratome kulturer fra spytkirtler, dyrket deres sektioner i 0% eller 10% FBS suppleret Media19,20. Mus submandibulære skiver blev opdelt i en tykkelse på 50 μm …

Discussion

Salivary kirtel forskning har udnyttet en række kultur modeller, herunder udødeliggjort 2-d kulturer, primære 2-d kulturer, 3-d salisphere kulturer, og 3-d organ kulturer fra embryonale eksplanteret væv at fastslå spørgsmål om underliggende biologi og fysiologi. Disse kultur modeller har givet indsigtsfulde oplysninger på tværs af en bred vifte af forskningsspørgsmål og vil fortsat være vigtige værktøjer i spyt forskning. Begrænsningerne af disse kultur modeller omfatter graduering af P53 aktivitet under i…

Materials

Vibratome VT1000S	Leica Biosystems	N/A	Vibratome for sectioning
Double Edge Stainless Steel Razor Blades	Electron Microscopy Sciences	72000
Agarose	Fisher Scientific	BP165-25	Low-melt
Parafilm	Sigma-Aldrich	P6543
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B	Lonza	17-745H	PSA
24-well plate	CellTreat	229124
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Gibco	14190-144
Loctite UltraGel Control Superglue	Loctite	N/A	Purchased at hardware store
Natural Red Sable Round Paintbrush	Princeton Art & Brush Co	7400R-2
Gentamicin Sulfate	Fisher Scientific	ICN1676045
Transferrin	Sigma-Aldrich	T-8158-100mg
L-glutatmine	Gibco	25030-081
Trace Elements	MP Biomedicals	ICN1676549
Insulin	Fisher Scientific	12585014
Epidermal Growth Factor	Corning	354001
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0888
Retinoic acid	Fisher Scientific	R2625-50MG
Fetal Bovine Serum	Gibco	A3160602
DMEM/F12 Media	Corning	150-90-CV
Millicell Cell Culture Insert	Millipore Sigma	PICM01250	12 mm, 0.4 um pore size for 24 well plate
0.4% Trypan Blue	Sigma-Aldrich	T8154
LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570)	Thermo-Fisher	R37601	Only used LIVE dye component
Anti-Ki-67 Antibody	Cell Signaling Technology	9129S
Anti-E-cadherin Antibody	Cell Signaling Technology	3195S
Anti-Cleaved Caspase-3 Antibody	Cell Signaling Technology	9661L
Anti-SMA Antibody	Sigma-Aldrich	C6198
Anti-amylase Antibody	Sigma-Aldrich	A8273
Anti-CD31 Antibody	Abcam	ab28364
Anti-TUBB3 Antibody	Cell Signaling Technology	5568S
Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit	Thermo-Fisher	A20185
Alexa Fluor 594 Phalloidin	Thermo-Fisher	A12381
Bovine Serum Albumin	Fisher Scientific	BP1600
Triton X-100	Sigma-Aldrich	21568-2500
Paraformaldehyde Prills	Fisher Scientific	5027632
New England Nuclear Blocking Agent	Perkin Elmer	2346249	No longer sold
DAPI	Cell Signaling Technology	4083S
Prolong Gold Antifade Mounting Media	Invitrogen	P36934
Leica SPSII Spectral Confocal	Leica Biosystems	N/A	For confocal imaging
Leica DMIL Inverted Phase Contrast Microscope	Leica Biosystems	N/A
Cobalt-60 Teletherapy Instrument	Atomic Energy of Canada Ltd Theratron-80	N/A
Amac Box, Clear	The Container Store	60140	Agarose block mold