Ved hjelp av tredimensjonale organotypic kulturer for å visualisere morfologi og funksjonelle markører for spyttkjertler kan gi romanen innsikt i mekanismer for vevsskade etter stråling. Beskrevet her er en protokoll til del, kultur, irradiate, beis, og bilde 50-90 μm tykke spyttkjertel seksjoner før og etter eksponering for ioniserende stråling.
Hyposalivation og xerostomia skape kroniske muntlige komplikasjoner som reduserer livskvaliteten i hode og nakke kreftpasienter som er behandlet med strålebehandling. Eksperimentelle tilnærminger til forståelse mekanismer av spyttkjertel dysfunksjon og restaurering har fokusert på in vivo-modeller, som er handikappet av en manglende evne til systematisk skjermen terapeutiske kandidater og effektivitet i transfeksjoner evne til å manipulere spesifikke gener. Hensikten med denne spyttkjertel organotypic kultur protokoll er å evaluere maksimal tid for kultur levedyktighet og karakterisere cellulære endringer etter ex vivo strålebehandling. Vi benyttet immunofluorescent farging og konfokalmikroskopi mikroskopi for å avgjøre når bestemte celle populasjoner og markører er til stede under en 30-dagers kultur periode. I tillegg blir celle markører som tidligere er rapportert i in vivo stråling-modeller evaluert i kulturer som er bestrålt ex vivo. Fremover, denne metoden er en attraktiv plattform for rask ex vivo vurdering av murine og menneskelig spyttkjertel vev reaksjoner på terapeutiske midler som forbedrer spytt funksjon.
Riktig spyttkjertel funksjon er avgjørende for oral helse og endres etter hode og nakke kreft behandling med strålebehandling1. I 2017 ble nesten 50 000 nye tilfeller av hode-og nakke kreft rapportert i USA2. På grunn av vev-ødeleggende og ofte irreversible effekter av strålebehandling på omkringliggende normalt vev som spyttkjertler, pasienter er ofte igjen med alvorlige bivirkninger og redusert livskvalitet2,3, firetil. Vanlige komplikasjoner forårsaket av stråle skade manifesterer i symptomer som xerostomia (den subjektive følelsen av tørr munn), tannråte, nedsatt evne til å tygge og svelge, tale nedsatt funksjonsevne, og kompromittert oral microbiomes2, 3 andre priser , 4. disse symptomene kollektivt kan føre til underernæring og nedsatt overlevelse i berørte individer5. Mens spyttkjertel dysfunksjon i denne populasjonen har vært godt dokumentert, har de underliggende mekanismene for skade på acinar celler vært omstridt, og det er lite integrasjon mellom ulike dyremodeller6,7.
Den nåværende metoder for å studere spyttkjertel funksjon og stråling-indusert skade inkluderer bruk av in vivo-modeller, udødeliggjort cellelinjer, todimensjonal (2-D) primær cellekulturer, og tredimensjonale (3-D) salisphere kulturer8, 9,10,11,12. Tradisjonelt vil cellekultur modeller fra udødeliggjort cellelinjer og 2D-kulturer involvere enkelt lags celler kultivert på flate overflater og er verdifulle for rask, enkel og kostnadseffektiv eksperimentering. Imidlertid kan kunstig cellekultur forhold endre differensiering status og fysiologiske reaksjoner av celler eksponert for ulike forhold, og resultatene ofte ikke å oversette til hele organismen modeller14,15. I tillegg udødeliggjort cellekulturer krever modulering av p53 aktivitet, noe som er avgjørende for spyttkjertel respons på DNA skade16,17.
3-D salisphere kulturer er beriket for Stem og stamceller ved tidlig tidspunkt i kultur og har vært nyttig for å forstå radiosensitivity av denne undergruppe av spyttkjertel celler9,18. En kritisk begrensning av alle disse kultur modeller er de er ineffektive i å visualisere 3-D strukturen i spyttkjertel, inkludert ekstracellulære matrise (ECM) og celle-celle interaksjoner over ulike lag, som er avgjørende i modulerende spytt sekresjon15. Behovet for en metode som omfatter virkemåten til vevet som helhet, men kan også manipuleres under laboratorieforhold for å studere virkningene av behandlingen er nødvendig for å ytterligere oppdage de underliggende mekanismene for stråling-indusert spyttkjertel Dysfunksjon.
Levende vev snitting og kultur har blitt dokumentert tidligere19,20 og brukes ofte til å studere hjerne-vev interaksjoner21. I tidligere studier, parotid (PAR) spyttkjertel vev fra mus ble delt på ca 50 μm og kultivert for opp til 48 h, og analyse av levedyktighet, celle død, og funksjonen ble utført deretter19. Su et al. (2016) utvidet på denne metodikken ved dyrking humant submandibular kjertler (SMGs) delt på 35 μm eller 50 μm for 14 dager20. Den foreslåtte metoden er en fremgang i at det inkluderer både parotid og submandibular spyttkjertler delt på 50 μm og 90 μm og evaluering av kulturer i 30 dager. Evnen til å kutte en rekke vev tykkelse er viktig i å evaluere celle-celle og Cell-ECM interaksjoner som er relevante for cellulære prosesser inkludert apikale-basolateral polaritet og innervasjon for sekresjon. Videre spyttkjertel skiver var bestrålt mens i kultur for å bestemme muligheten for denne kulturen modellen for å studere stråling-indusert spyttkjertel skade.
Hensikten med denne spyttkjertel organotypic kultur protokoll er å evaluere maksimal tid for kultur levedyktighet og karakterisere cellulære endringer etter ex vivo strålebehandling. For å bestemme maksimal tid seksjoner som er levedyktig post-disseksjon, trypan blå farging, levende celle farging, og immunhistokjemiske farging for celle død ble utført. Konfokalmikroskopi mikroskopi og immunofluorescent farging ble benyttet for å evaluere spesifikke celle populasjoner, morfologiske strukturer, og nivåer av spredning. Vevs-delen kulturer ble også utsatt for ioniserende stråling å bestemme virkningene av stråling på ulike markører i denne 3-D modellen. Induksjon av celle død, cytoskjelettkomponenter avbrudd, tap av differensiering markører, og kompenserende spredning i bestrålt ex vivo kulturer ble sammenlignet med tidligere studier av in vivo-modeller. Denne metoden gir et middel til å undersøke hvilken rolle celle-celle interaksjoner etter stråling skader og gir en eksperimentell modell for å effektivt evaluere effekten av terapeutiske intervensjoner (Gen manipulasjoner eller farmakologiske midler ) som kan være mindre egnet for in vivo-modeller.
Spyttkjertel forskning har benyttet en rekke kultur modeller, inkludert udødeliggjort 2-D kulturer, primære 2-D kulturer, 3-D salisphere kulturer, og 3-D orgel kulturer fra embryonale explants å konstatere spørsmål om underliggende biologi og fysiologi. Disse kultur modeller har gitt innsiktsfull informasjon på tvers av et variert utvalg av forskning spørsmål og vil fortsette å være viktige verktøy i spytt forskning. Begrensningene i disse kultur modellene inkluderer modulering av p53 aktivitet under immortali…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet delvis av piloten finansiering levert av University of Arizona Office of Research and Discovery og National Institutes of Health (R01 DE023534) til Kirsten Limesand. Den Cancer biologi Training Grant, T32CA009213, forutsatt stipend støtte for Wen Yu Wong. Forfatterne vil gjerne takke M. Rice for hans verdifulle tekniske bidrag.
Vibratome VT1000S | Leica Biosystems | N/A | Vibratome for sectioning |
Double Edge Stainless Steel Razor Blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
Agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | Low-melt |
Parafilm | Sigma-Aldrich | P6543 | |
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B | Lonza | 17-745H | PSA |
24-well plate | CellTreat | 229124 | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco | 14190-144 | |
Loctite UltraGel Control Superglue | Loctite | N/A | Purchased at hardware store |
Natural Red Sable Round Paintbrush | Princeton Art & Brush Co | 7400R-2 | |
Gentamicin Sulfate | Fisher Scientific | ICN1676045 | |
Transferrin | Sigma-Aldrich | T-8158-100mg | |
L-glutatmine | Gibco | 25030-081 | |
Trace Elements | MP Biomedicals | ICN1676549 | |
Insulin | Fisher Scientific | 12585014 | |
Epidermal Growth Factor | Corning | 354001 | |
Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | |
Retinoic acid | Fisher Scientific | R2625-50MG | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | A3160602 | |
DMEM/F12 Media | Corning | 150-90-CV | |
Millicell Cell Culture Insert | Millipore Sigma | PICM01250 | 12 mm, 0.4 um pore size for 24 well plate |
0.4% Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570) | Thermo-Fisher | R37601 | Only used LIVE dye component |
Anti-Ki-67 Antibody | Cell Signaling Technology | 9129S | |
Anti-E-cadherin Antibody | Cell Signaling Technology | 3195S | |
Anti-Cleaved Caspase-3 Antibody | Cell Signaling Technology | 9661L | |
Anti-SMA Antibody | Sigma-Aldrich | C6198 | |
Anti-amylase Antibody | Sigma-Aldrich | A8273 | |
Anti-CD31 Antibody | Abcam | ab28364 | |
Anti-TUBB3 Antibody | Cell Signaling Technology | 5568S | |
Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit | Thermo-Fisher | A20185 | |
Alexa Fluor 594 Phalloidin | Thermo-Fisher | A12381 | |
Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 21568-2500 | |
Paraformaldehyde Prills | Fisher Scientific | 5027632 | |
New England Nuclear Blocking Agent | Perkin Elmer | 2346249 | No longer sold |
DAPI | Cell Signaling Technology | 4083S | |
Prolong Gold Antifade Mounting Media | Invitrogen | P36934 | |
Leica SPSII Spectral Confocal | Leica Biosystems | N/A | For confocal imaging |
Leica DMIL Inverted Phase Contrast Microscope | Leica Biosystems | N/A | |
Cobalt-60 Teletherapy Instrument | Atomic Energy of Canada Ltd Theratron-80 | N/A | |
Amac Box, Clear | The Container Store | 60140 | Agarose block mold |