Tratamiento de radiación de cultivos organotípico de glándulas salivales submandibulares y parótidas modelos clave en vivo características
Summary
El uso de cultivos organotípica tridimensionales para visualizar la morfología y los marcadores funcionales de las glándulas salivales puede proporcionar ideas novedosas sobre los mecanismos de daño tisular después de la radiación. Aquí se describe un protocolo de sección, cultura, irradiar, mancha, y la imagen de 50 – 90 μm grueso secciones de la glándula salival antes y después de la exposición a la radiación ionizante.
Abstract
La hiposalivación y la xerostomía crean complicaciones orales crónicas que disminuyen la calidad de vida en pacientes con cáncer de cabeza y cuello que reciben tratamiento con radioterapia. Los enfoques experimentales para comprender los mecanismos de disfunción y restauración de las glándulas salivales se han centrado en los modelos in vivo, que se encuentran discapacitados por la incapacidad de sistematiar sistemáticamente a los candidatos terapéuticos y la eficiencia en la transfección capacidad de manipular genes específicos. El propósito de este protocolo de cultivo organotípico de la glándula salival es evaluar el tiempo máximo de viabilidad de la cultura y caracterizar los cambios celulares después del tratamiento de radiación ex vivo. Utilizamos la tinción inmunofluorescente y la microscopía confocal para determinar cuándo están presentes poblaciones y marcadores específicos de células durante un período de cultivo de 30 días. Además, los marcadores celulares notificados previamente en modelos de radiación in vivo se evalúan en cultivos irradiados ex vivo. Avanzando, este método es una plataforma atractiva para la evaluación rápida ex vivo de las respuestas del tejido de las glándulas salivales murinas y humanas a los agentes terapéuticos que mejoran la función salival.
Introduction
La función de la glándula salival adecuada es esencial para la salud bucal y se altera después del tratamiento del cáncer de cabeza y cuello con radioterapia1. En 2017, se notificaron cerca de 50.000 casos nuevos de cáncer de cabeza y cuello en los Estados Unidos2. Debido a los efectos perjudiciales para los tejidos y con frecuencia irreversibles de la radioterapia en los tejidos normales circundantes, como las glándulas salivales, a los pacientes a menudo se les deja con efectos secundarios graves y disminución de la calidad de vida2,3, 4. Las complicaciones comunes causadas por el daño por radiación se manifiestan en síntomas como la xerostomía (la sensación subjetiva de sequedad bucal), la caries dental, la capacidad deteriorada para masticar y tragar, las deficiencias del habla y los microbiomas orales comprometidos2, 3 , 4. estos síntomas colectivamente pueden conducir a la desnutrición y la supervivencia deteriorada en los individuos afectados5. Mientras que la disfunción de las glándulas salivales en esta población ha sido bien documentada, los mecanismos subyacentes de daño a las células acinares han sido cuestionados, y hay poca integración entre los diferentes modelos animales6,7.
Los métodos actuales de estudio de la función de la glándula salival y el daño inducido por la radiación incluyen el uso de modelos in vivo, líneas celulares inmortalizadas, cultivos de células primarias bidimensionales (2-D) y culturas tridimensionales (3-D) de la salifera8, 9,10,11,12. Tradicionalmente, los modelos de cultivo celular de líneas celulares inmortalizadas y cultivos en 2-D implican células de capas únicas cultivadas en superficies planas y son valiosas para una experimentación rápida, fácil y rentable. Sin embargo, las condiciones de cultivo celular artificial pueden alterar el estado de diferenciación y las respuestas fisiológicas de las células expuestas a diversas afecciones, y los resultados a menudo no se traducen a los modelos de organismos enteros14,15. Además, los cultivos celulares inmortalizados requieren la modulación de la actividad de p53, que es fundamental para la respuesta de la glándula salival al daño del ADN16,17.
las culturas salisfera 3-D se enriquecen para las células madre y progenitoras en los primeros momentos de la cultura y han sido útiles para comprender la radiosensibilidad de este subconjunto de células de la glándula salival9,18. Una limitación crítica de todos estos modelos de cultivo es que son ineficaces en la visualización de la estructura 3-D de la glándula salival, incluyendo la matriz extracelular (ECM) y las interacciones de células celulares sobre varias capas, que son cruciales en la modulación de salivales secreción15. La necesidad de un método que abarque el comportamiento del tejido en su conjunto, pero también puede ser manipulado en condiciones de laboratorio para estudiar los efectos del tratamiento es necesario para descubrir los mecanismos subyacentes de la glándula salival inducida por radiación disfunción.
La seccionamiento de tejido vivo y la cultura se han documentado previamente19,20 y a menudo se utiliza para estudiar interacciones cerebro-tejido21. En estudios previos, el tejido parótida (PAR) de las glándulas salivales de los ratones se seccionó a aproximadamente 50 μm y se cultivó hasta 48 h, y se realizaron análisis de viabilidad, muerte celular y función a partir de entonces19. Su et al. (2016) ampliado en esta metodología mediante el cultivo de glándulas submandibulares humanas (SMG) seccionadas a 35 μm o 50 μm durante 14 días20. El método propuesto es un avance en el que incluye las glándulas salivales parótidas y submandibulares seccionadas a 50 μm y 90 μm y la evaluación de los cultivos durante 30 días. La capacidad de cortar una gama de espesor de tejido es importante en la evaluación de las interacciones célula-célula y Cell-ECM que son relevantes para los procesos celulares incluyendo la polaridad apical-basolateral y la inervación para la secreción. Además, las rebanadas de las glándulas salivales fueron irradiadas mientras estaban en cultivo para determinar la viabilidad de este modelo de cultivo para estudiar el daño causado por la glándula salival inducida por radiación.
El propósito de este protocolo de cultivo organotípico de la glándula salival es evaluar el tiempo máximo de viabilidad de la cultura y caracterizar los cambios celulares después del tratamiento de radiación ex vivo. Para determinar las secciones máximas de tiempo que son viables después de la disección, se realizaron manchas azules de tripan, tinción de células vivas e inmunohistoquímica para la muerte celular. La microscopía confocal y la tinción inmunofluorescente se utilizaron para evaluar poblaciones celulares específicas, estructuras morfológicas y niveles de proliferación. Los cultivos de sección de tejido también se exponían a la radiación ionizante para determinar los efectos de la radiación en varios marcadores en este modelo 3-D. Se comparó la inducción de la muerte celular, la alteración del citoesqueleto, la pérdida de marcadores de diferenciación y la proliferación compensatoria en cultivos ex vivo irradiados a estudios previos de modelos in vivo. Esta metodología proporciona un medio para investigar el papel de las interacciones de células celulares tras el daño por radiación y proporciona un modelo experimental para evaluar eficientemente la eficacia de las intervenciones terapéuticas (manipulaciones genéticas o agentes farmacológicos ) que pueden ser menos adecuados para los modelos in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
La investigación de glándulas salivales ha utilizado una serie de modelos de cultivo, incluyendo culturas 2-D inmortalizadas, cultivos primarios 2-D, cultivos salisales 3-D, y cultivos de órganos 3-D de explantas embrionarias para determinar preguntas sobre la biología subyacente y la fisiología. Estos modelos de cultura han arrojado información perspicaz a través de una diversa variedad de preguntas de investigación y seguirán siendo herramientas importantes en la investigación salival. Las limitaciones de est…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado en parte por la financiación piloto proporcionada por la oficina de investigación y descubrimiento de la Universidad de Arizona y los institutos nacionales de salud (r01 DE023534) a Kirsten Limesand. La beca de capacitación en Biología del cáncer, T32CA009213, proporcionó apoyo de estipendio a Wen Yu Wong. A los autores les gustaría agradecer a M. Rice su valiosa contribución técnica.
Materials
| Vibratome VT1000S | Leica Biosystems | N/A | Vibratome for sectioning |
| Double Edge Stainless Steel Razor Blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | Low-melt |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P6543 | |
| Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B | Lonza | 17-745H | PSA |
| 24-well plate | CellTreat | 229124 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco | 14190-144 | |
| Loctite UltraGel Control Superglue | Loctite | N/A | Purchased at hardware store |
| Natural Red Sable Round Paintbrush | Princeton Art & Brush Co | 7400R-2 | |
| Gentamicin Sulfate | Fisher Scientific | ICN1676045 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T-8158-100mg | |
| L-glutatmine | Gibco | 25030-081 | |
| Trace Elements | MP Biomedicals | ICN1676549 | |
| Insulin | Fisher Scientific | 12585014 | |
| Epidermal Growth Factor | Corning | 354001 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | |
| Retinoic acid | Fisher Scientific | R2625-50MG | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A3160602 | |
| DMEM/F12 Media | Corning | 150-90-CV | |
| Millicell Cell Culture Insert | Millipore Sigma | PICM01250 | 12 mm, 0.4 um pore size for 24 well plate |
| 0.4% Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570) | Thermo-Fisher | R37601 | Only used LIVE dye component |
| Anti-Ki-67 Antibody | Cell Signaling Technology | 9129S | |
| Anti-E-cadherin Antibody | Cell Signaling Technology | 3195S | |
| Anti-Cleaved Caspase-3 Antibody | Cell Signaling Technology | 9661L | |
| Anti-SMA Antibody | Sigma-Aldrich | C6198 | |
| Anti-amylase Antibody | Sigma-Aldrich | A8273 | |
| Anti-CD31 Antibody | Abcam | ab28364 | |
| Anti-TUBB3 Antibody | Cell Signaling Technology | 5568S | |
| Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit | Thermo-Fisher | A20185 | |
| Alexa Fluor 594 Phalloidin | Thermo-Fisher | A12381 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 21568-2500 | |
| Paraformaldehyde Prills | Fisher Scientific | 5027632 | |
| New England Nuclear Blocking Agent | Perkin Elmer | 2346249 | No longer sold |
| DAPI | Cell Signaling Technology | 4083S | |
| Prolong Gold Antifade Mounting Media | Invitrogen | P36934 | |
| Leica SPSII Spectral Confocal | Leica Biosystems | N/A | For confocal imaging |
| Leica DMIL Inverted Phase Contrast Microscope | Leica Biosystems | N/A | |
| Cobalt-60 Teletherapy Instrument | Atomic Energy of Canada Ltd Theratron-80 | N/A | |
| Amac Box, Clear | The Container Store | 60140 | Agarose block mold |
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