Strål behandling av Organotypiska kulturer från submandibular och parotid Salivary körtlar modeller Key in vivo egenskaper

Summary

Användning av tredimensionella organiska kulturer för att visualisera morfologi och funktionella markörer för spott körtlar kan ge nya insikter i mekanismerna för vävnads skada efter strålning. Beskrivs här är ett protokoll till avsnitt, kultur, irradiate, fläcken, och bild 50 – 90 μm tjocka Saliv körtel sektioner före och efter exponering för joniserande strålning.

Abstract

Hyposalivering och mun torrhet skapa kroniska orala komplikationer som minskar livskvaliteten i huvud-och hals cancer patienter som behandlas med strål behandling. Experimentella metoder för att förstå mekanismer för spott körtel dysfunktion och restaurering har fokuserat på in vivo-modeller, som är handikappade av en oförmåga att systematiskt skärm terapeutiska kandidater och effektivitets vinster i transfektion förmåga att manipulera specifika gener. Syftet med detta protokoll för Saliv körtel organotypisk kultur är att utvärdera maximal tid för kulturens livs kraft och karakterisera cell förändringar efter ex vivo-strålbehandling. Vi utnyttjade Immunofluorescerande färgning och konfokalmikroskopi för att avgöra när specifika cell populationer och markörer är närvarande under en 30-dagars kultur period. Dessutom utvärderas cell markörer som tidigare rapporter ATS i in vivo-strålningsmätningar i kulturer som är bestrålade ex vivo. Att gå framåt, denna metod är en attraktiv plattform för snabb ex vivo bedömning av murina och mänskliga Saliv körtel vävnad svar på terapeutiska medel som förbättrar spott funktion.

Introduction

Ordentlig spott körtel funktion är nödvändig för oral hälsa och ändras efter huvud-och hals cancer behandling med strål terapi¹. I 2017, nästan 50 000 nya fall av huvud-och hals cancer rapporterades i USA². På grund av den vävnads skada och ofta oåterkalleliga effekter av strål behandling på omgivande normala vävnader såsom saliv körtlar, patienter är ofta kvar med allvarliga biverkningar och minskad livskvalitet^2,3, med ⁴. Vanliga komplikationer orsakade av strålnings skador manifesteras i symtom som mun torrhet (den subjektiva känslan av mun torrhet), karies, nedsatt förmåga att tugga och svälja, tal svårigheter, och nedsatt orala mikrobiomer^{2, 3} för att ^{, 4}. dessa symtom kan kollektivt leda till undernäring och försämrad överlevnad hos drabbade individer⁵. Medan Saliv körtel dysfunktion i denna population har väldokumenterade, de bakomliggande mekanismerna för skador på acinar celler har ifrågasatts, och det finns lite integration mellan olika djur modeller^6,7.

De nuvarande metoderna för att studera Saliv körtel funktion och Strålningsinducerade skador inkluderar användning av in vivo-modeller, förevigas cellinjer, tvådimensionella (2D) primära cell kulturer, och tredimensionella (3-D) salisphere kulturer^{8, 9,10,11,12}. Traditionellt, cell kulturer modeller från förevigat cellinjer och 2-D kulturer involverar enskiktade celler odlade på plana ytor och är värdefulla för snabba, enkla och kostnads effektiva experiment. Emellertid, konstgjorda cell odlings förhållanden kan förändra differentierings status och fysiologiska svar av celler som utsätts för olika förhållanden, och resultaten ofta Miss lyckas med att översätta till hela organismen modeller^14,15. Dessutom kräver odödligade cell kulturer modulering av p53-aktivitet, vilket är kritiskt för Saliv körtel reaktionen på DNA-skador^16,17.

3-D salisphere kulturer berikas för stamceller och stamcells celler vid tidiga tidpunkter i kulturen och har varit användbara för att förstå radiosensitiviteten hos denna delmängd av Saliv körtel cellerna^9,18. En kritisk begränsning av alla dessa kultur modeller är att de är ineffektiva i att visualisera 3D-strukturen av Saliv körtel, inklusive extracellulär matrix (ECM) och cell-cell interaktioner över olika skikt, som är avgörande för modulerande saliv utsöndringen¹⁵. Behovet av en metod som omfattar beteendet hos vävnaden som helhet, men kan också manipuleras under laboratorie förhållanden för att studera effekterna av behandlingen är nödvändigt för att ytterligare upptäcka de bakomliggande mekanismerna för strålningsinducerad Saliv körtel Dysfunktion.

Levande vävnad snittning och kultur har dokumenterats tidigare^19,20 och används ofta för att studera hjärn vävnad interaktioner²¹. I tidigare studier, parotis (par) Saliv körtel vävnad från möss var Snittade vid cirka 50 μm och odlade för upp till 48 h, och analys av lönsamhet, celldöd, och funktion utfördes därefter¹⁹. Su et al. (2016) expanderade på denna metod genom odling av humana submandibular körtlar (SMGs) snittas vid 35 μm eller 50 μm i 14 dagar²⁰. Den föreslagna metoden är en avancemang i att den innehåller både parotis och submandibular spott körtlar snittas på 50 μm och 90 μm och utvärdering av kulturerna för 30 dagar. Förmågan att skära en rad vävnad tjocklek är viktigt för att utvärdera cell-cell och cell-ECM interaktioner som är relevanta för cellulära processer inklusive apikal-basolateral polaritet och innervation för utsöndring. Dessutom var spott körtel skivor bestrålas medan i kulturen för att fastställa genomförbarheten av denna kultur modell för att studera strålnings-inducerad Saliv körtel skada.

Syftet med detta protokoll för Saliv körtel organotypisk kultur är att utvärdera maximal tid för kulturens livs kraft och karakterisera cell förändringar efter ex vivo-strålbehandling. För att fastställa den maximala tid avsnitt som är livskraftig efter dissektion, trypan blå färgning, levande cell färgning, och immunohistokemisk färgning för celldöd utfördes. Konfokalmikroskopi och Immunofluorescerande färgning utnyttjades för att utvärdera specifika cell populationer, morfologiska strukturer och spridnings nivåer. Vävnads sektion kulturer utsattes också för joniserande strålning för att bestämma effekterna av strålning på olika markörer i denna 3-D-modell. Induktion av celldöd, cytoskelettrelaterade störningar, förlust av differentierings markörer och kompensatorisk spridning i bestrålade ex vivo-kulturer jämfördes med tidigare studier av in vivo-modeller. Denna metod ger ett sätt att undersöka cell cellernas interaktioner efter strålnings skador och ger en experimentell modell för att effektivt utvärdera effekten av terapeutiska ingrepp (gen manipulationer eller farmakologiska agens ) som kan vara mindre lämpade för in vivo-modeller.

Protocol

1. beredning av vibratome Spraya löstagbara delar av vibratomen inklusive Buffertbricka, blad fäste, AGA ros block mögel, och laboratorie film med 70% etanol, sedan UV-sterilisera i minst 30 min. Placera och säkra ett extra ark med laboratorie film över buffertbrickan för att förhindra att is faller in. Fyll iskammaren med krossad is, ta bort laboratorie filmen från buffertbrickan och fyll buffertbrickan med 100 mL iskall 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS), kompletterad med 1% penic…

Representative Results

Primära 2-D kulturer odlas i Foster nötkreatur serum (FBS) kompletteras Media medan primära 3-D salisphere kultur är typiskt odlade i serum-fria villkor10,11. I tillägg de två föregående studierna som använder vibratome kulturer från spott körtlar odlade deras delar upp i 0% eller 10% FBS kompletterade massmedia19,20. Mus submandibular skivor var snittas med en …

Discussion

Saliv körtel forskning har utnyttjat ett antal kultur modeller, inklusive förevigas 2-d kulturer, primära 2-d kulturer, 3-d salisphere kulturer, och 3-d orgel kulturer från embryonala blad sticklingar att fastställa frågor om underliggande biologi och fysiologi. Dessa kultur modeller har gett insiktsfulla information över en mängd olika forsknings frågor och kommer att fortsätta att vara viktiga verktyg i spott forskning. Begränsningarna i dessa kultur modeller inkluderar modulering av p53-aktivitet under odö…

Materials

Vibratome VT1000S	Leica Biosystems	N/A	Vibratome for sectioning
Double Edge Stainless Steel Razor Blades	Electron Microscopy Sciences	72000
Agarose	Fisher Scientific	BP165-25	Low-melt
Parafilm	Sigma-Aldrich	P6543
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B	Lonza	17-745H	PSA
24-well plate	CellTreat	229124
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Gibco	14190-144
Loctite UltraGel Control Superglue	Loctite	N/A	Purchased at hardware store
Natural Red Sable Round Paintbrush	Princeton Art & Brush Co	7400R-2
Gentamicin Sulfate	Fisher Scientific	ICN1676045
Transferrin	Sigma-Aldrich	T-8158-100mg
L-glutatmine	Gibco	25030-081
Trace Elements	MP Biomedicals	ICN1676549
Insulin	Fisher Scientific	12585014
Epidermal Growth Factor	Corning	354001
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0888
Retinoic acid	Fisher Scientific	R2625-50MG
Fetal Bovine Serum	Gibco	A3160602
DMEM/F12 Media	Corning	150-90-CV
Millicell Cell Culture Insert	Millipore Sigma	PICM01250	12 mm, 0.4 um pore size for 24 well plate
0.4% Trypan Blue	Sigma-Aldrich	T8154
LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570)	Thermo-Fisher	R37601	Only used LIVE dye component
Anti-Ki-67 Antibody	Cell Signaling Technology	9129S
Anti-E-cadherin Antibody	Cell Signaling Technology	3195S
Anti-Cleaved Caspase-3 Antibody	Cell Signaling Technology	9661L
Anti-SMA Antibody	Sigma-Aldrich	C6198
Anti-amylase Antibody	Sigma-Aldrich	A8273
Anti-CD31 Antibody	Abcam	ab28364
Anti-TUBB3 Antibody	Cell Signaling Technology	5568S
Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit	Thermo-Fisher	A20185
Alexa Fluor 594 Phalloidin	Thermo-Fisher	A12381
Bovine Serum Albumin	Fisher Scientific	BP1600
Triton X-100	Sigma-Aldrich	21568-2500
Paraformaldehyde Prills	Fisher Scientific	5027632
New England Nuclear Blocking Agent	Perkin Elmer	2346249	No longer sold
DAPI	Cell Signaling Technology	4083S
Prolong Gold Antifade Mounting Media	Invitrogen	P36934
Leica SPSII Spectral Confocal	Leica Biosystems	N/A	For confocal imaging
Leica DMIL Inverted Phase Contrast Microscope	Leica Biosystems	N/A
Cobalt-60 Teletherapy Instrument	Atomic Energy of Canada Ltd Theratron-80	N/A
Amac Box, Clear	The Container Store	60140	Agarose block mold