Submandibular ve parotis tükürük bezlerinden Organotipik kültürlerin radyasyon tedavisi anahtar In vivo özellikleri
Summary
Morfoloji ve tükürük bezlerinin fonksiyonel belirteçleri görselleştirmek için üç boyutlu organotypic kültürler kullanarak radyasyon aşağıdaki doku hasarı mekanizmaları yeni anlayış sağlayabilir. Burada açıklanan bölüm, kültür, ışınlama, leke ve görüntü 50 – 90 μm kalınlığında tükürük bezi bölümleri önce ve iyonlaştırıcı radyasyon maruz aşağıdaki bir protokoldür.
Abstract
Hiposalivasyon ve ağız kuruluğu, radyoterapi ile tedavi edilen baş ve boyun kanseri hastalarında yaşam kalitesini azaltan kronik sözlü komplikasyonlar yaratır. Tükürük bezi fonksiyon bozukluğu ve restorasyon mekanizmalarının anlaşılması için deneysel yaklaşımlar, sistematik olarak terapötik adaylara ve transfeksiyon verimliliklerini ekrana getiren bir yetersizlik ile engelli olan in vivo modellerde duruldu belirli genler işlemek için yeteneği. Bu tükürük bezi organotypic kültür protokolünün amacı, kültürün en uygun süresini değerlendirmek ve ex vivo radyasyon tedavisinden sonra hücresel değişiklikleri karakterize etmektir. 30 günlük kültür döneminde belirli hücre nüfus ve işaretçileri ne zaman bulunduğunu belirlemek için immünofluorescent boyama ve Konfokal mikroskopisi kullandık. Buna ek olarak, daha önce in vivo radyasyon modellerinde bildirilen hücresel işaretler, ex vivo ışınlanmış kültürlerde değerlendirilir. İleriye doğru hareket eden bu yöntem, tükürük fonksiyonunu geliştiren terapötik ajanlar için duvar ve insan tükürük bezi dokusu yanıtlarının hızlı ex vivo değerlendirmesi için cazip bir platformdur.
Introduction
Uygun tükürük bezi fonksiyonu ağız sağlığı için esastır ve radyoterapi ile baş ve boyun kanseri tedavisi aşağıdaki değiştirilir1. 2017 yılında Amerika Birleşik Devletleri2‘ de yaklaşık 50.000 yeni baş ve boyun kanseri vakaları bildirilmiştir. Doku-zararlı ve genellikle tükürük bezleri gibi normal dokulara çevreleyen radyasyon tedavisinin geri dönüşümsüz etkileri nedeniyle, hastalar sıklıkla ciddi yan etkileri ve azalan yaşam kalitesi ile bırakılır2,3, 4‘ ü yapın. Aksostomi (Kuru ağız subjektif hissi), diş çürükleri, çiğnemek ve yutmak, konuşma bozuklukları ve tehlikeye oral mikrobiomes2 gibi semptomlarda radyasyon hasar belirtileri nedeniyle yaygın komplikasyonlar, 3 ‘ ü , 4. bu belirtiler topluca kötü beslenme ve etkilenen bireyler hayatta kalma bozukluğu yol açabilir5. Bu nüfusun tükürük bezi disfonksiyon iyi belgelenmiş iken, asiner hücrelerine hasar temel mekanizmaları tartışmalı olmuştur, ve farklı hayvan modelleri arasında az entegrasyon vardır5/6.
Tükürük bezi fonksiyonu ve radyasyona bağlı hasar eğitimi mevcut yöntemler in vivo modellerin kullanımı dahil, ölümsüzleştirilmiş hücre hatları, iki boyutlu (2-D) Primer hücre kültürlerinin, ve üç boyutlu (3-D) salisphere kültürler8, 9,10,11,12. Geleneksel olarak, ölümsüzleştirilmiş hücre hatları ve 2-D kültürler hücre kültürü modelleri düz yüzeyler üzerinde kültürlü tek katmanlı hücreler içerir ve hızlı, kolay ve maliyet-etkili deney için değerlidir. Bununla birlikte, yapay hücre kültürü koşulları çeşitli koşullara maruz kalan hücrelerin farklılaşma durumunu ve fizyolojik yanıtlarını değiştirebilir ve sonuçlar genellikle tüm organizmalar için14,15‘ e tercüme etme başarısız olur. Buna ek olarak, ölümsüzleştirilmiş hücre kültürlerinde DNA hasarı için tükürük bezi tepkisi için kritik p53 aktivite, modülasyon gerektirir16,17.
3-D salisphere kültürler, kültür erken zaman noktalarında kök ve progenitör hücreler için zenginleştirilmiştir ve bu tükürük bezi hücrelerinin bu alt kümesinin radyosensitivite anlamak için yararlı olmuştur9,18. Tüm bu kültür modellerinin kritik bir sınırlaması, tükürük bezinin 3-b yapısının görselleştirilmesinde etkisiz olup, çeşitli katmanlar üzerinde hücre içi matris (ECM) ve hücreler arası etkileşimler de dahil olmak üzere, tükürük modülasyon açısından çok önemlidir. salgı15. Bir bütün olarak doku davranışını kapsar ama aynı zamanda tedavinin etkilerini incelemek için laboratuvar koşullarında manipüle edilebilir bir yöntem için ihtiyaç daha da radyasyon kaynaklı tükürük bezi temel mekanizmaları keşfetmek için gereklidir Disfonksiyon.
Canlı doku bölümleme ve kültür önceden belgelenmiştir19,20 ve genellikle beyin-doku etkileşimleri incelemek için kullanılan21. Önceki çalışmalarda, farelerden parotis (PAR) tükürük bezi dokusu yaklaşık 50 μm ‘ ye kadar yer aldı ve 48 h ‘ye kadar Kültürlenmiş, daha sonra19‘ luk, hücre ölümü ve fonksiyon analizi yapıldı. Su ve Al. (2016) Bu metodoloji üzerinde, insan submandibular bezlerinin (SMGs) 35 μm veya 50 μm ‘ de 14 gün20‘ ye kadar bölünerek genişletilmiştir. Önerilen yöntem, 50 μm ve 90 μm ‘ de kesitli parotis ve submandibular tükürük bezleri ve kültürlerin 30 gün boyunca değerlendirilmesi içeren bir gelişmedir. Bir dizi doku kalınlığının kesilmesi yeteneği, apikal-basolateral Polarite ve salgılanma için innervasyon dahil olmak üzere hücresel süreçler için ilgili hücre hücresi ve hücre-ECM etkileşimlerini değerlendirmede önemlidir. Ayrıca, tükürük bezi dilimleri radyasyon kaynaklı tükürük bezi hasarı incelemek için bu kültür modelinin fizibilitesi belirlemek için kültürde iken ışınlanmış.
Bu tükürük bezi organotypic kültür protokolünün amacı, kültürün en uygun süresini değerlendirmek ve ex vivo radyasyon tedavisinden sonra hücresel değişiklikleri karakterize etmektir. Kalıcı Post-diseksiyon olan maksimum zaman bölümlerini belirlemek için, tripan mavi boyama, canlı hücre boyama ve hücre ölümü için immunhistokimyasal boyama yapıldı. Özel hücre popülasyonları, morfolojik yapıları ve proliferasyon düzeylerini değerlendirmek için Konfokal mikroskobik ve immünofluorescent boyama kullanılmıştır. Doku bölümü kültürlerinin de bu 3-b modelinde çeşitli işaretçileri üzerinde radyasyon etkilerini belirlemek için iyonlaştırıcı radyasyon maruz kalmıştı. Hücre ölümü indüksiyonu, sitorinasyon bozulması, ayrım işaretçileri kaybı ve ışınlanmış ex vivo kültürlerde telafi edici proliferasyon, In vivo modellerin önceki çalışmalarla karşılaştırıldı. Bu metodoloji, radyasyon hasarını takiben hücre-hücre etkileşimlerinin rolünü araştırmak için bir yol sağlar ve terapötik müdahalelerin etkinliğini (gen manipülasyonları veya farmakolojik ajanlar) etkili bir şekilde değerlendirmek için deneysel bir model sağlar ) in vivo modellerde daha az uygun olabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tükürük bezi araştırmaları, ölümsüzleşmiş 2-d kültürler, primer 2-d kültürler, 3-d salisphere kültürler ve embriyonik Method 3-b organ kültürlerini temel biyoloji ve Fizyoloji hakkında bazı soruları tespit etmek gibi birçok kültür modelini kullandı. Bu kültür modelleri araştırma soruları çeşitli bir dizi üzerinde anlayışlı bilgi vermiştir ve tükürük araştırma önemli araçlar olmaya devam edecektir. Bu kültür modellerinin sınırlamaları, ölümsüzleştirme sırasında p53 a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Arizona Üniversitesi araştırma ve keşif ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01 DE023534) tarafından Kirsten Limesand için sağlanan pilot finansman tarafından kısmen destekleniyordu. Kanser biyoloji eğitim Grant, T32CA009213, Wen yu Wong için maaş desteği sağladı. Yazarlar değerli teknik katkısı için M. Rice teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Vibratome VT1000S | Leica Biosystems | N/A | Vibratome for sectioning |
| Double Edge Stainless Steel Razor Blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | Low-melt |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P6543 | |
| Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B | Lonza | 17-745H | PSA |
| 24-well plate | CellTreat | 229124 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco | 14190-144 | |
| Loctite UltraGel Control Superglue | Loctite | N/A | Purchased at hardware store |
| Natural Red Sable Round Paintbrush | Princeton Art & Brush Co | 7400R-2 | |
| Gentamicin Sulfate | Fisher Scientific | ICN1676045 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T-8158-100mg | |
| L-glutatmine | Gibco | 25030-081 | |
| Trace Elements | MP Biomedicals | ICN1676549 | |
| Insulin | Fisher Scientific | 12585014 | |
| Epidermal Growth Factor | Corning | 354001 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | |
| Retinoic acid | Fisher Scientific | R2625-50MG | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A3160602 | |
| DMEM/F12 Media | Corning | 150-90-CV | |
| Millicell Cell Culture Insert | Millipore Sigma | PICM01250 | 12 mm, 0.4 um pore size for 24 well plate |
| 0.4% Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570) | Thermo-Fisher | R37601 | Only used LIVE dye component |
| Anti-Ki-67 Antibody | Cell Signaling Technology | 9129S | |
| Anti-E-cadherin Antibody | Cell Signaling Technology | 3195S | |
| Anti-Cleaved Caspase-3 Antibody | Cell Signaling Technology | 9661L | |
| Anti-SMA Antibody | Sigma-Aldrich | C6198 | |
| Anti-amylase Antibody | Sigma-Aldrich | A8273 | |
| Anti-CD31 Antibody | Abcam | ab28364 | |
| Anti-TUBB3 Antibody | Cell Signaling Technology | 5568S | |
| Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit | Thermo-Fisher | A20185 | |
| Alexa Fluor 594 Phalloidin | Thermo-Fisher | A12381 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 21568-2500 | |
| Paraformaldehyde Prills | Fisher Scientific | 5027632 | |
| New England Nuclear Blocking Agent | Perkin Elmer | 2346249 | No longer sold |
| DAPI | Cell Signaling Technology | 4083S | |
| Prolong Gold Antifade Mounting Media | Invitrogen | P36934 | |
| Leica SPSII Spectral Confocal | Leica Biosystems | N/A | For confocal imaging |
| Leica DMIL Inverted Phase Contrast Microscope | Leica Biosystems | N/A | |
| Cobalt-60 Teletherapy Instrument | Atomic Energy of Canada Ltd Theratron-80 | N/A | |
| Amac Box, Clear | The Container Store | 60140 | Agarose block mold |
References
- Dirix, P., Nuyts, S., Van den Bogaert, W. Radiation-induced xerostomia in patients with head and neck cancer: a literature review. Cancer. 107 (11), 2525-2534 (2006).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer Statistics, 2017. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).
- Hancock, P. J., Epstein, J. B., Sadler, G. R. Oral and dental management related to radiation therapy for head and neck cancer. Journal of the Canadian Dental Association. 69 (9), 585-590 (2003).
- Nguyen, N. P., et al. Quality of life following chemoradiation and postoperative radiation for locally advanced head and neck cancer. Journal for Oto-rhino-laryngology and Its Related Specialties. 69 (5), 271-276 (2007).
- Gorenc, M., Kozjek, N. R., Strojan, P. Malnutrition and cachexia in patients with head and neck cancer treated with (chemo)radiotherapy. Reports of Practical Oncology and Radiotherapy. Journal of Greatpoland Cancer Center in Poznań and Polish Society of Radiation Oncology. 20 (4), 249-258 (2015).
- Grundmann, O., Mitchell, G. C., Limesand, K. H. Sensitivity of salivary glands to radiation: from animal models to therapies. Journal of Dental Research. 88 (10), 894-903 (2009).
- Konings, A. W., Coppes, R. P., Vissink, A. On the mechanism of salivary gland radiosensitivity. International Journal of Radiation Oncology, Biology, and Physics. 62 (4), 1187-1194 (2005).
- Chan, Y. -. H., Huang, T. -. W., Young, T. -. H., Lou, P. -. J. Human salivary gland acinar cells spontaneously form three-dimensional structures and change the protein expression patterns. Journal of Cellular Physiology. 226 (11), 3076-3085 (2011).
- Nguyen, V. T., Dawson, P., Zhang, Q., Harris, Z., Limesand, K. H. Administration of growth factors promotes salisphere formation from irradiated parotid salivary glands. PLoS ONE. 13 (3), e0193942 (2018).
- Limesand, K. H., et al. Characterization of Rat Parotid and Submandibular Acinar Cell Apoptosis In Primary Culture. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 39 (3), 170 (2003).
- Wei, L., Xiong, H., Li, W., Li, B., Cheng, Y. Upregulation of IL-6 expression in human salivary gland cell line by IL-17 via activation of p38 MAPK, ERK, PI3K/Akt, and NF-κB pathways. Journal of Oral Pathology & Medicine. 47 (9), 847-855 (2018).
- Chuong, C., Katz, J., Pauley, K. M., Bulosan, M., Cha, S. RAGE expression and NF-κB activation attenuated by extracellular domain of RAGE in human salivary gland cell line. Journal of Cellular Physiology. 221 (2), 430-434 (2009).
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
- Bhadriraju, K., Chen, C. S. Engineering cellular microenvironments to improve cell-based drug testing. Drug Discovery Today. 7 (11), 612-620 (2002).
- Breslin, S., O’Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
- Avila, J. L., Grundmann, O., Burd, R., Limesand, K. H. Radiation-induced salivary gland dysfunction results from p53-dependent apoptosis. International Journal of Radiation Oncology, Biololgy, Physics. 73 (2), 523-529 (2009).
- Mitchell, G. C., et al. IGF1 activates cell cycle arrest following irradiation by reducing binding. of DeltaNp63 to the p21 promoter. Cell Death & Disease. 1, (2010).
- Lombaert, I. M. A., et al. Rescue of Salivary Gland Function after Stem Cell Transplantation in Irradiated Glands. PLoS ONE. 3 (4), (2008).
- Warner, J. D., et al. Visualizing form and function in organotypic slices of the adult mouse parotid gland. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 295 (3), G629-G640 (2008).
- Su, X., et al. Three-dimensional organotypic culture of human salivary glands: the slice culture model. Oral Diseases. 22 (7), 639-648 (2016).
- Mattei, G., Cristiani, I., Magliaro, C., Ahluwalia, A. Profile analysis of hepatic porcine and murine brain tissue slices obtained with a vibratome. PeerJ – The Journal of Life and Environmental Sciences. 3, 932 (2015).
- Pawley, J. . Handbook of Biological Confocal Microscopy. , (2006).
- Limesand, K. H., et al. Insulin-Like Growth Factor-1 Preserves Salivary Gland Function After Fractionated Radiation. International Journal of Radiation Oncology, Biology, and Physics. 78 (2), 579-586 (2010).
- Grundmann, O., Fillinger, J. L., Victory, K. R., Burd, R., Limesand, K. H. Restoration of radiation therapy-induced salivary gland dysfunction in mice by post therapy IGF-1 administration. BMC Cancer. 10, 417 (2010).
- Chibly, A. M., et al. aPKCzeta-dependent Repression of Yap is Necessary for Functional Restoration of Irradiated Salivary Glands with IGF-1. Scientific Reports. 8 (1), 6347 (2018).
- Wong, W. Y., Pier, M., Limesand, K. H. Persistent disruption of lateral junctional complexes and actin cytoskeleton in parotid salivary glands following radiation treatment. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 315 (4), R656-R667 (2018).
- Emmerson, E., et al. SOX2 regulates acinar cell development in the salivary gland. eLife. 6, (2017).
- Nedvetsky, P. I., et al. Parasympathetic innervation regulates tubulogenesis in the developing salivary gland. Developmental Cell. 30 (4), 449-462 (2014).
- Kwon, H. R., Nelson, D. A., DeSantis, K. A., Morrissey, J. M., Larsen, M. Endothelial cell regulation of salivary gland epithelial patterning. Development. 144 (2), 211-220 (2017).
- Mellas, R. E., Leigh, N. J., Nelson, J. W., McCall, A. D., Baker, O. J. Zonula occludens-1, occludin and E-cadherin expression and organization in salivary glands with Sjogren’s syndrome. Jounral of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (1), 45-56 (2015).
- Daley, W. P., et al. Btbd7 is essential for region-specific epithelial cell dynamics and branching morphogenesis in vivo. Development. 144 (12), 2200-2211 (2017).
- Nam, K., et al. Post-Irradiated Human Submandibular Glands Display High Collagen Deposition, Disorganized Cell Junctions, and an Increased Number of Adipocytes. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 64 (6), 343-352 (2016).
