Capture de petites molécules Communication entre les tissus et les cellules à l’aide d’imagerie de la spectrométrie de masse
Summary
Une nouvelle méthode de préparation de l’échantillon a été développée pour accueillir la co-culture de cellules et de tissus pour détecter l’échange de petites molécules à l’aide de la spectrométrie de masse d’imagerie.
Abstract
Imagerie de spectrométrie de masse (IMS) a été systématiquement appliquée à trois types d’échantillons : coupes tissulaires, sphéroïdes et colonies microbiennes. Ces types d’échantillons ont été analysés à l’aide de spectrométrie de désorption-ionisation laser assistée par matrice time-of-flight masse (MALDI-TOF MS) de visualiser la répartition des protéines, des lipides et métabolites dans l’ensemble de l’échantillon biologique d’intérêt. Nous avons développé une méthode de préparation d’échantillon roman qui combine les forces des trois demandes précédentes pour déterminer une démarche sous-explorée pour identifier la communication chimique dans le cancer, par ensemencement des cultures de cellules de mammifères en gel d’agarose dans coculture avec des tissus sains, suivies par la dessiccation de l’échantillon. Cellules et tissus de mammifères sont cultivées à proximité permettant la communication chimique par diffusion entre les tissus et les cellules. À des moments spécifiques, l’échantillon d’agarose est séché de la même manière que des colonies microbiennes préparé pour l’analyse de l’IMS. Notre méthode a été développée afin de modéliser la communication entre le cancer des ovaires séreuse haut grade dérivé de la trompe de Fallope comme il interagit avec l’ovaire au cours de la métastase. Optimisation de la préparation de l’échantillon a permis l’identification de la noradrénaline comme composante chimique clé dans le microenvironnement ovarienne. Cette méthode nouvellement mis au point peut être appliquée à d’autres systèmes biologiques qui nécessitent une compréhension de la communication chimique entre les cellules adjacentes ou de tissus.
Introduction
Imagerie de la spectrométrie de masse (IMS) a été optimisé afin de caractériser la distribution spatiale des caractéristiques moléculaires en trois applications utilisées : tranches de tissus, sphéroïdes et colonies microbiennes1,2,3. Tranches de tissus peuvent servir à évaluer la localisation des métabolites dans le contexte des conditions biologiques dans une foule, ciblées ou non ciblées dans une plage de masse déterminée. Toutefois, les différences entre les caractéristiques moléculaires sont la plus importante et la plus évidente lorsqu’un tissu sain est comparé à une condition de malade, par exemple, une tumeur. Cette approche de l’IMS est particulièrement adaptée à la détection des biomarqueurs de la maladie, cependant, acquisition d’échantillons de tissus à des stades distincts dans la progression de la maladie (par exemple les grades de la tumeur) s’oppose à l’identification des signaux qui pourraient être importantes pour l’initiation de la maladie. L’échange d’informations par le biais de l’espace est un élément omniprésent de nombreux systèmes biologiques, et tranches de tissus ne peuvent pas capturer ce relais dynamique chimique. Une technique qui peut être capable de visualiser la diffusion et l’échange chimique est IMS des colonies microbiennes cultivées sur gélose ; petites molécules peuvent se diffuser à travers et l’agar et peuvent être capturés par l’intermédiaire de spectrométrie de masse (MALDI-TOF) de désorption-ionisation laser assistée par matrice4. Cette configuration de croissance peut être utilisée pour identifier des molécules échangées entre des entités biologiques discrets (colonies) et peut aussi déterminer la directionnalité de la production de métabolites. La plate-forme conçue initialement pour la croissance des colonies microbiennes a été adaptée pour explorer le métabolisme primaire des tissus explants cultivés avec des cellules de mammifères, et IMS a été utilisée pour évaluer l’échange chimique dynamique dans un système in vitro chez les mammifères.
Dans les dernières années, il est devenu clair que le cancer ovarien séreux de haut grade (HGSOC) est souvent originaire de l’épithélium de la trompe de Fallope (ETP) et puis métastase dans l’ovaire au cours de la maladie début développement5,6, 7 , 8. la raison que les ETP tumorigène cellules propagation à l’ovaire, où les grosses tumeurs finissent par forment et métastases plus loin, est actuellement incertaine. Des recherches antérieures a mis l’accent sur le rôle des protéines ovariens à la métastase primaire à l’ovaire ; Toutefois, il a récemment été démontré que la transition entre un milieu sain et un tissu tumorigène entraîne une perturbation massive du métabolisme cellulaire et modifie la production de petites molécules9,10,11. C’est pourquoi, nous avons supposé que les petites molécules échangées entre l’ETP et de l’ovaire peuvent être en partie responsables de la métastase primaire de HGSOC.
En suivant notre procédure IMS nouvellement mis au point, nous avons déterminé que co-culture d’ETP tumorigène et tissu ovarien sain induit la production de noradrénaline par l’ovaire. Toutefois, autres types de cellules ou les cellules normales d’ETP ne pas permis d’obtenir cet effet. Un extraordinaire avantage de cette méthode est que la production moléculaire et l’échange de signaux qui représentent de véritables molécules peuvent être visualisées, ainsi, même dans une co-culture, il est possible de déterminer la source d’un signal. Il s’agit d’un avantage par rapport à l’analyse des échantillons homogénéisés, où toutes les informations spatiales sont perdues. Dans notre système de modèle, nous avons pu clairement affecter la production de noradrénaline à l’ovaire. La noradrénaline a été liée à la chimiorésistance des cancers de l’ovaire et des métastases, et notre détection de cette molécule a validé que la nouvelle méthode IMS peut découvrir des molécules biologiquement pertinente12,13, 14. cette validation nous permet de proposer que cette nouvelle application d’IMS peut être particulièrement utile pour les groupes qui sont efforcent d’identifier des petites molécules dans des environnements de co-culture et pour comprendre les événements précoces qui influent sur la transformation des cellules de recherche et la métastase. L’objectif général de cette méthode est d’élucider l’identité et la distribution spatiale des petites molécules au cours de l’échange entre les tissus et organes, représentées par cultures de cellules 3D de in vitro ou ex vivo des tissus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il y a un nombre croissant d’une preuve qui implique le rôle de la noradrénaline en HGSOC12,17,18, et cette technique a fourni de l’information plus mécaniste. Au moins huit conditions biologiques présentes sur la même lame, la méthode peut expliquer les contrôles biologiques telles que gène et spécificité cellulaire ainsi que des contrôles de médias dans un seul IMS run. Alors que la méthode a été optimisée …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A été financé par le Consortium de recherche biomédicale de Chicago avec l’appui des fonds Searle à The Chicago Community Trust (C-076) (L.M.S.) ; University of Illinois at Chicago démarrage finance (L.M.S.) ; Grant 543296 de l’Alliance de fonds de recherche de Cancer de l’ovaire (M.D.) ; et UG3 ES029073 (J.E.B.) et par le National Center for Advancing translationnelle Sciences, Institut National de la santé, par le biais de subvention UL1TR002003 (JEB & LMS).
Materials
| 15 mL Falcon tubes | Denville | C1017-O | To collect cells |
| 8-well chamber (Millipore EZ-slide chamber) | Millipore | PEZGS0816 | Repurposed from Millipore Millicell EZ-slide chamber slide |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998-4L | Solvent for sprayed matrix |
| Alpha Minimum Essential Medium (αMEM) | Fisher | 10-022-CV | Cell culture media |
| Autoflex speed MALDI-TOF LRF | Bruker | For IMS data analysis | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | To collect cells and remove supernatant |
| CHCA Matrix | Bruker Daltonic | 8201344 | Matrix sprayed onto dried slide |
| DHB Matrix | Bruker Daltonic | 8201346 | Matrix sprayed onto dried slide |
| Disposable Scalpels | Fisher | 22-079-707 | For removal of the ovaries |
| Dissecting Scissors | Fisher | 13-804-6 | For removal of the ovaries |
| DMEM Media | Gibco | 11995-065 | Media mixed with agarose |
| epidermal growth factor | Peprotech Inc. | 100-15 | Cell culture media supplement |
| Eppendorf tubes | Genesee Scientific | 22-282 | For agarose aliquots |
| Estradiol-17β | Simga-Aldrich | E2758 | Cell culture media supplement |
| Fetal Bovine Serum | Denville | fb5001 | Cell culture media supplement |
| FlexControl 3.4 | Bruker Daltonic | IMS data acquisition software | |
| FlexImaging 4.1 | Bruker Daltonic | IMS data analysis software | |
| Forceps (fine) | Fsiher | 22-327379 | For removal of the ovaries |
| Gentamycin | Cellgro | 30-005-CR | Cell culture media supplement |
| Insulin, Transferrin, Selenium (ITS) | Sigma-Aldrich | 11074547001 | Cell culture media supplement |
| ITO-coated slide | Bruker | 8237001 | Platform for co-culture incubation |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 11415064 | Media used during tissue dissection |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | Cell culture media supplement |
| Low-melting agarose | Sigma-Aldrich | A9414-10G | Mixed with media for plating |
| Media basin | Corning | 4870 | Used to cut plastic dividers for divided chambers |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | Cell culture media supplement |
| Peptide Calibration Standard | Bruker Daltonic | 8206195 | Calibrant for medium mass range |
| Phophorus red | Sigma-Aldrich | 343-242-5G | Calibrant for low mass range |
| SCiLS Lab 2015 | Bruker Daltonic | IMS data statistical analysis | |
| Surgical Forceps (blunt) | Fisher | 08-875-8B | For removal of the ovaries |
| TFA | Fisher Technologies | A116-50 | Added to matrix solution |
| TM Sprayer | HTX Technologies | For applying matrix |
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