Acquisizione di piccola molecola comunicazione tra tessuti e cellule mediante spettrometria di massa di Imaging
Summary
Un nuovo metodo di preparazione del campione è stato sviluppato per ospitare coculture delle cellule e del tessuto per rilevare cambio piccola molecola usando la spettrometria totale imaging.
Abstract
Spettrometria di massa (IMS) di imaging ordinariamente è stato applicato a tre tipi di campioni: sezioni di tessuto, sferoidi e le colonie microbiche. Questi tipi di campioni sono stati analizzati mediante spettrometria di massa tempo-di-volo del desorbimento/ionizzazione laser assistito da matrice (MALDI-TOF MS) per visualizzare la distribuzione di proteine, lipidi e metaboliti attraverso il campione biologico di interesse. Abbiamo sviluppato un metodo di preparazione del campione romanzo che unisce i punti di forza delle tre applicazioni precedenti per affrontare un approccio underexplored per l’identificazione di comunicazione chimica nel cancro, tramite la semina di colture di cellule di mammifero in agarosio in coculture con tessuti sani seguiti da essiccazione del campione. Cellule e tessuti di mammiferi sono cocultured nelle immediate vicinanze permettendo la comunicazione chimica tramite diffusione tra i tessuti e le cellule. Intervalli di tempo specifici, il campione basato su agarosio è asciugato nello stesso modo come colonie microbiche preparato per l’analisi IMS. Il nostro metodo è stato sviluppato per la comunicazione tra cancro ovarico sieroso di alta qualità derivata dal tubo fallopian come interagisce con l’ovaia durante metastasi di modello. Ottimizzazione della preparazione del campione ha portato alla identificazione di noradrenalina come componente chimico chiave nel microambiente ovarico. Questo metodo di recente sviluppato può essere applicato ad altri sistemi biologici che richiedono una comprensione della comunicazione chimica tra celle adiacenti o tessuti.
Introduction
Spettrometria di massa (IMS) di imaging è stato ottimizzato per caratterizzare la distribuzione spaziale delle caratteristiche molecolari in tre applicazioni ampiamente usate: fettine di tessuto, sferoidi e colonie microbiche1,2,3. Fettine di tessuto possono essere utilizzati per valutare la localizzazione di metaboliti nel contesto di condizioni biologiche in un host, mirati o ciechi in uno specifico intervallo di massa. Tuttavia, le differenze tra le caratteristiche molecolari sono il più significativo ed evidente quando un tessuto sano è rispetto a una condizione di malato, ad esempio, un tumore. Questo approccio IMS è particolarmente adatto alla rilevazione di biomarcatori di malattia, tuttavia, l’acquisizione di campioni di tessuto alle fasi discrete in progressione di malattia (ad esempio, classi di tumore) esclude l’identificazione dei segnali che potrebbero essere importanti per l’inizio della malattia. Lo scambio di informazioni attraverso lo spazio è una caratteristica onnipresente di molti sistemi biologici, e fettine di tessuto non possono catturare questo relè chimico dinamico. Una tecnica che è in grado di visualizzare la diffusione e lo scambio chimico è IMS di colonie microbiche coltivate su piastre di agar; piccole molecole sono in grado di diffondere attraverso e l’agar e possono essere acquisiti tramite spettrometria di massa di matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI-TOF)4. Questa configurazione di crescita può essere utilizzata per identificare le molecole scambiati tra entità biologiche discrete (colonie) e può anche determinare la direzionalità della produzione del metabolita. La piattaforma progettata originariamente per la crescita di colonie microbiche è stata adattata per esplorare il metabolismo primario degli espianti di tessuto coltivato con cellule di mammifero e IMS è stato usato per valutare lo scambio chimico dinamico in un sistema di mammiferi in vitro.
Negli ultimi anni, è diventato chiaro che il cancro ovarico sieroso di alto grado (HGSOC) spesso ha origine nell’epitelio del tubo fallopian (FTE) e quindi si riproduce per metastasi all’ovaia durante malattia precoce sviluppo5,6, 7 , 8. il motivo che FTE tumorigeniche cellule diffusione all’ovaia, dove grandi tumori alla fine formano e riprodurrsi per metastasi ulteriormente, è attualmente poco chiaro. Precedenti ricerche si sono concentrate sul ruolo delle proteine ovariche nella metastasi primaria all’ovaia; Tuttavia, recentemente è stato dimostrato che la transizione da un sano ad un tessuto cancerogeno provoca enorme perturbazione del metabolismo cellulare e altera la produzione di piccole molecole9,10,11. Di conseguenza, abbiamo supposto che piccole molecole scambiati tra il FTE e l’ovaia possono essere parzialmente responsabile di metastasi primaria di HGSOC.
Utilizzando la nostra procedura IMS recente sviluppato, abbiamo determinato che coculture delle FTE tumorigeniche e tessuto ovarico sano induce la produzione di noradrenalina dall’ovaio. Tuttavia, in altri tipi cellulari o cellule normali FTE non hanno provocato questo effetto. Un beneficio straordinario di questo metodo è che la produzione molecolare e lo scambio di segnali che rappresentano molecole reali possono essere visualizzati, quindi anche in un coculture è possibile determinare l’origine di un segnale. Questo è un vantaggio sopra l’analisi dei campioni omogeneizzati, dove si perde tutte le informazioni spaziali. Nel nostro sistema modello, siamo stati in grado di assegnare chiaramente la produzione di noradrenalina all’ovaia. Noradrenalina è stata collegata alla metastasi e chemioresistenza dei cancri ovarici, e nostro rilevamento di questa molecola ha convalidato che il nuovo metodo IMS può scoprire molecole biologicamente rilevanti12,13, 14. questa convalida ci permette di proporre che questa nuova applicazione di IMS può essere particolarmente utile per ricercare gruppi che tentano di identificare piccole molecole in ambienti coculture e per comprendere i primi eventi che influenzano la trasformazione delle cellule e la metastasi. L’obiettivo generale di questo metodo è quello di delucidare l’identità e la distribuzione spaziale di piccole molecole durante lo scambio tra tessuti e organi, rappresentati da in vitro colture cellulari 3D o ex vivo del tessuto.
Protocol
Representative Results
Discussion
C’è un corpo crescente di prova che implica il ruolo di noradrenalina in HGSOC12,17,18, e questa tecnica ha contribuito più meccanicistici informazioni. Con almeno otto condizioni biologiche presenti nella stessa diapositiva, il metodo può rappresentare controlli biologici come gene e specificità delle cellule come pure i controlli multimediali in un singolo IMS eseguire. Mentre il metodo è stato ottimizzato per valutare sc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finanziamento è stato fornito dal Consorzio biomedica di Chicago con il supporto dei fondi Searle a The Chicago Community Trust (C-076) (L.M.S.); University of Illinois at Chicago avvio fondi (L.M.S); Grant 543296 dall’alleanza di fondo di ricerca di cancro ovarico (M.D.); e UG3 ES029073 (J.E.B) e dal centro nazionale per avanzare traslazionale Scienze, Istituto nazionale di salute, attraverso la concessione UL1TR002003 (JEB & LMS).
Materials
| 15 mL Falcon tubes | Denville | C1017-O | To collect cells |
| 8-well chamber (Millipore EZ-slide chamber) | Millipore | PEZGS0816 | Repurposed from Millipore Millicell EZ-slide chamber slide |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998-4L | Solvent for sprayed matrix |
| Alpha Minimum Essential Medium (αMEM) | Fisher | 10-022-CV | Cell culture media |
| Autoflex speed MALDI-TOF LRF | Bruker | For IMS data analysis | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | To collect cells and remove supernatant |
| CHCA Matrix | Bruker Daltonic | 8201344 | Matrix sprayed onto dried slide |
| DHB Matrix | Bruker Daltonic | 8201346 | Matrix sprayed onto dried slide |
| Disposable Scalpels | Fisher | 22-079-707 | For removal of the ovaries |
| Dissecting Scissors | Fisher | 13-804-6 | For removal of the ovaries |
| DMEM Media | Gibco | 11995-065 | Media mixed with agarose |
| epidermal growth factor | Peprotech Inc. | 100-15 | Cell culture media supplement |
| Eppendorf tubes | Genesee Scientific | 22-282 | For agarose aliquots |
| Estradiol-17β | Simga-Aldrich | E2758 | Cell culture media supplement |
| Fetal Bovine Serum | Denville | fb5001 | Cell culture media supplement |
| FlexControl 3.4 | Bruker Daltonic | IMS data acquisition software | |
| FlexImaging 4.1 | Bruker Daltonic | IMS data analysis software | |
| Forceps (fine) | Fsiher | 22-327379 | For removal of the ovaries |
| Gentamycin | Cellgro | 30-005-CR | Cell culture media supplement |
| Insulin, Transferrin, Selenium (ITS) | Sigma-Aldrich | 11074547001 | Cell culture media supplement |
| ITO-coated slide | Bruker | 8237001 | Platform for co-culture incubation |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 11415064 | Media used during tissue dissection |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | Cell culture media supplement |
| Low-melting agarose | Sigma-Aldrich | A9414-10G | Mixed with media for plating |
| Media basin | Corning | 4870 | Used to cut plastic dividers for divided chambers |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | Cell culture media supplement |
| Peptide Calibration Standard | Bruker Daltonic | 8206195 | Calibrant for medium mass range |
| Phophorus red | Sigma-Aldrich | 343-242-5G | Calibrant for low mass range |
| SCiLS Lab 2015 | Bruker Daltonic | IMS data statistical analysis | |
| Surgical Forceps (blunt) | Fisher | 08-875-8B | For removal of the ovaries |
| TFA | Fisher Technologies | A116-50 | Added to matrix solution |
| TM Sprayer | HTX Technologies | For applying matrix |
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