Molécula pequeña comunicación entre tejidos y células mediante espectrometría de masas en la proyección de imagen de captura
Summary
Un novedoso método de preparación de la muestra fue desarrollado para acomodar el cocultivo de células y tejidos para detectar cambio de molécula pequeña usando spectrometry total de la proyección de imagen.
Abstract
Espectrometría de masas (IMS) la proyección de imagen rutinaria se ha aplicado a tres tipos de muestras: tejido, esferoides y colonias microbianas. Estos tipos de muestras se han analizado mediante láser asistida por matriz de desorción/ionización tiempo de vuelo espectrometría de masas (MALDI-TOF MS) para visualizar la distribución de las proteínas, lípidos y metabolitos en muestras biológicas de interés. Hemos desarrollado un método de preparación de la novela muestra que combina las ventajas de las tres aplicaciones anteriores para abordar un enfoque underexplored para la identificación de comunicación química en cáncer, por la siembra de cultivos de células mamíferas en agarosa en cocultivo con tejidos sanos, seguidos de desecación de la muestra. Las células y tejidos de mamíferos son morfología en proximidad cercana, permitiendo la comunicación química a través de la difusión entre el tejido y las células. En momentos específicos, se seca la muestra basado en la agarosa de la misma manera que las colonias microbianas preparado para el análisis IMS. Nuestro método se desarrolló para modelar la comunicación entre el cáncer de ovario seroso de alto grado derivada de la trompa de Falopio como interactúa con el ovario durante la metástasis. Optimización de la preparación de la muestra dio como resultado la identificación de la noradrenalina como un componente clave de la química en el microambiente ovárico. Este nuevo método puede aplicarse a otros sistemas biológicos que requieren una comprensión de la comunicación química entre las células adyacentes o los tejidos.
Introduction
Espectrometría de masas (IMS) de imágenes ha sido optimizada para caracterizar la distribución espacial de características moleculares en tres aplicaciones ampliamente utilizadas: rebanadas de tejido, esferoides y colonias microbianas1,2,3. Rebanadas de tejido pueden utilizarse para evaluar la localización de los metabolitos en el contexto de las condiciones biológicas en un host, ya sea dirigido o no dirigido dentro de un intervalo específico de masa. Sin embargo, las diferencias entre características moleculares son los más evidentes y significativos comparados con un tejido sano es una condición enferma, por ejemplo, un tumor. Este enfoque IMS es particularmente adaptado a la detección de biomarcadores de la enfermedad, sin embargo, adquirir muestras de tejido en etapas discretas de progresión de la enfermedad (por ejemplo, grados de tumor) impide la identificación de señales que podrían ser importantes para la iniciación de la de la enfermedad. El intercambio de información a través del espacio es una característica omnipresente de muchos sistemas biológicos, y rebanadas de tejido no pueden capturar esta dinámica química relé. Una técnica que es capaz de visualizar la difusión y el intercambio químico es IMS de microbianas colonias cultivadas en placas de agar; pequeñas moléculas son capaces de difundir a través de y en el agar y pueden ser capturadas mediante láser asistida por matriz (MALDI-TOF) de desorción/ionización espectrometría de masas4. Esta configuración de crecimiento puede utilizarse para identificar moléculas intercambiadas entre entidades biológicas discretas (colonias) y también puede determinar la direccionalidad de la producción del metabolito. La plataforma diseñada originalmente para el crecimiento de la Colonia microbiana se adaptó para explorar el metabolismo primario de explantes de tejido convertido células de mamífero, y IMS se utilizó para evaluar el intercambio químico dinámico en un sistema mamífero in vitro.
En los últimos años, ha quedado claro que el cáncer de ovario seroso de alto grado (HGSOC) a menudo se origina en el epitelio de la trompa de Falopio (FTE) y luego se extiende por metástasis al ovario durante la enfermedad temprana de desarrollo5,6, 7 , 8. la razón por la que FTE tumorigenic células propagación al ovario, donde grandes tumores eventualmente forman y hacen metástasis más, es actualmente confusa. Investigaciones anteriores se ha centrado en el papel de proteínas ováricos primaria metástasis al ovario; sin embargo, recientemente ha sido demostrado que la transición de una saludable a un tejido tumorigenic resulta en interrupción masiva del metabolismo celular y altera la producción de moléculas pequeñas9,10,11. Por lo tanto, la hipótesis de que moléculas pequeñas entre la FTE y el ovario pueden ser en parte responsables primaria metástasis de HGSOC.
Con nuestro procedimiento IMS desarrollado recientemente, hemos determinado que cocultivo de FTE tumorigenic y tejido ovárico sano induce la producción de norepinefrina desde el ovario. Sin embargo, otros tipos de la célula o células FTE normales no provocan este efecto. Un beneficio extraordinario de este método es que se pueden visualizar la producción molecular e intercambio de señales que representan moléculas reales, por lo que incluso en un cocultivo es posible determinar la fuente de una señal. Esto es una ventaja sobre el análisis de las muestras homogeneizadas, donde se pierde toda la información espacial. En nuestro sistema modelo, hemos sido capaces de asignar claramente la producción de noradrenalina al ovario. La noradrenalina se ha relacionado con la metástasis y la quimiorresistencia de cánceres ováricos, y la detección de esta molécula ha validado que el novedoso método IMS puede descubrir moléculas biológicamente relevantes12,13, 14. Esta validación nos permite proponer que esta nueva aplicación de IMS puede ser particularmente útil para grupos que están intentando identificar moléculas pequeñas en entornos de cocultivo y para entender los acontecimientos tempranos que influyen en la transformación de la célula de investigación y metástasis. El objetivo general de este método es aclarar la identidad y la distribución espacial de moléculas pequeñas durante el intercambio entre los tejidos y órganos, representados en vitro los cultivos celulares 3D o tejido vivo ex .
Protocol
Representative Results
Discussion
Hay un cuerpo creciente de evidencia que implica el papel de la norepinefrina en el HGSOC12,17,18, y esta técnica ha aportado información más mecanicista. Con al menos ocho condiciones biológicas presentes en la misma diapositiva, el método puede explicar controles biológicos tales como gene y especificidad celular así como controles de los medios de comunicación en un solo IMS. Mientras que el método fue optimizado eva…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La financiación fue proporcionada por el consorcio biomédico de Chicago con el apoyo de los fondos de Searle en el Chicago Community Trust (C-076) (L.M.S.); Universidad de Illinois en Chicago Inicio fondos (L.M.S.); Donación de 543296 de la Alianza de fondo de investigación de cáncer de ovario (M.D.); y ES029073 UG3 (J.E.B.) y por el centro nacional para avanzar traslacional Ciencias, Instituto Nacional de salud, a través de subsidio UL1TR002003 (JEB & LMS).
Materials
| 15 mL Falcon tubes | Denville | C1017-O | To collect cells |
| 8-well chamber (Millipore EZ-slide chamber) | Millipore | PEZGS0816 | Repurposed from Millipore Millicell EZ-slide chamber slide |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998-4L | Solvent for sprayed matrix |
| Alpha Minimum Essential Medium (αMEM) | Fisher | 10-022-CV | Cell culture media |
| Autoflex speed MALDI-TOF LRF | Bruker | For IMS data analysis | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | To collect cells and remove supernatant |
| CHCA Matrix | Bruker Daltonic | 8201344 | Matrix sprayed onto dried slide |
| DHB Matrix | Bruker Daltonic | 8201346 | Matrix sprayed onto dried slide |
| Disposable Scalpels | Fisher | 22-079-707 | For removal of the ovaries |
| Dissecting Scissors | Fisher | 13-804-6 | For removal of the ovaries |
| DMEM Media | Gibco | 11995-065 | Media mixed with agarose |
| epidermal growth factor | Peprotech Inc. | 100-15 | Cell culture media supplement |
| Eppendorf tubes | Genesee Scientific | 22-282 | For agarose aliquots |
| Estradiol-17β | Simga-Aldrich | E2758 | Cell culture media supplement |
| Fetal Bovine Serum | Denville | fb5001 | Cell culture media supplement |
| FlexControl 3.4 | Bruker Daltonic | IMS data acquisition software | |
| FlexImaging 4.1 | Bruker Daltonic | IMS data analysis software | |
| Forceps (fine) | Fsiher | 22-327379 | For removal of the ovaries |
| Gentamycin | Cellgro | 30-005-CR | Cell culture media supplement |
| Insulin, Transferrin, Selenium (ITS) | Sigma-Aldrich | 11074547001 | Cell culture media supplement |
| ITO-coated slide | Bruker | 8237001 | Platform for co-culture incubation |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 11415064 | Media used during tissue dissection |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | Cell culture media supplement |
| Low-melting agarose | Sigma-Aldrich | A9414-10G | Mixed with media for plating |
| Media basin | Corning | 4870 | Used to cut plastic dividers for divided chambers |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | Cell culture media supplement |
| Peptide Calibration Standard | Bruker Daltonic | 8206195 | Calibrant for medium mass range |
| Phophorus red | Sigma-Aldrich | 343-242-5G | Calibrant for low mass range |
| SCiLS Lab 2015 | Bruker Daltonic | IMS data statistical analysis | |
| Surgical Forceps (blunt) | Fisher | 08-875-8B | For removal of the ovaries |
| TFA | Fisher Technologies | A116-50 | Added to matrix solution |
| TM Sprayer | HTX Technologies | For applying matrix |
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