العزلوالتقييم الكمي لخلايا الفرشاة من القصبة الهوائية للفأر
Summary
خلايا الفرشاة هي خلايا ظهارية حساسة كيميائية نادرة موجودة في القصبة الهوائية للفأر السذاجة. نظرا لأعدادهم المحدودة، وتقييم من الجسم الحي من دورهم الوظيفي في حصانة مجرى الهواء وإعادة عرض تحديا. نحن نصف طريقة لعزل خلايا فرشاة القصبة الهوائية عن طريق قياس التدفق.
Abstract
خلايا فرشاة القصبة الهوائية هي خلايا الظهارية الحسية الكيميائية الكولينية تستعد لنقل الإشارات من تجويف مجرى الهواء إلى الجهاز المناعي والعصبي. وهي جزء من عائلة من الخلايا الظهارية الحسية الكيميائية التي تشمل خلايا خصلة في الغشاء المخاطي المعوي، وخلايا الفرشاة في القصبة الهوائية، والخلايا الحسية الكيميائية الانفرادية والخلايا الدقيقة في الغشاء المخاطي للأنفية. تشترك الخلايا الحسية الكيميائية في المقصورات الظهارية المختلفة في علامات رئيسية داخل الخلايا وتوقيع النسخ الأساسي، ولكنها تظهر أيضًا تباينًا نسخيًا كبيرًا، مما يعكس على الأرجح بيئة الأنسجة المحلية. مطلوب عزل خلايا فرشاة القصبة الهوائية من تعليق خلية واحدة لتحديد وظيفة هذه الخلايا الظهارية النادرة بالتفصيل، ولكن عزلتها صعبة، وربما يرجع ذلك إلى التفاعل الوثيق بين خلايا فرشاة القصبة الهوائية والنهايات العصبية أو بسبب تكوين مجرى الهواء محددة من تقاطعات ضيقة وadherens. هنا، ونحن نصف إجراء لعزل خلايا الفرشاة من ظهارة القصبة الهوائية الماوس. ويستند الأسلوب على فصل أولي من ظهارة القصبة الهوائية من الغشاء المخاطي تحت المخاطية، مما يسمح لحضانة أقصر لاحقة من ورقة الظهارية مع الباباين. يوفر هذا الإجراء حلاً سريعاً ومريحاً لفرز التدفق السيتومتري والتحليل الوظيفي لخلايا فرشاة القصبة الهوائية القابلة للحياة.
Introduction
خلايا الفرشاة تنتمي إلى فئة من الخلايا الظهارية الكيميائية الحسية التي تتميز بالتعبير عن مستقبلات الذوق المر وطعم مستقبلات آلات تحويل وجدت في خلايا برعم الذوق. على عكس خلايا برعم الذوق، تنتشر الخلايا الظهارية الحسية الكيميائية في الأسطح الظهارية ويشار إليها باسم الخلايا الحسية الكيميائية الانفرادية (SCCs) والخلايا الدقيقة في ظهارة الأنف1،2، خلايا الفرشاة في القصبة الهوائية 3،4، وخلايا خصلة في الأمعاء5،6. كما توجد الخلايا الظهارية التي تعبر عن مستقبلات الطعم المر وآلات تحويل الطعم المر في مجرى البول7و8 والأنبوب السمعي9. خلايا فرشاة مجرى الهواء لها وظائف فريدة من نوعها في استجابات مجرى الهواء العصبي والمناعي. فهي الخلايا الحسية الكيميائية المنتجة لأستيل التي تثير ردود الفعل التنفسية الواقية عند التنشيط مع المركبات المريرة والأيض البكتيرية مثل المواد استشعار النصاب10. خلايا فرشاة مجرى الهواء هي أيضا المصدر الظهاري الرئيسي للمجرى الهوائي IL-25، الذيينظم التهاب النوع 2 من نوع 2 في المسالك الهوائية 3.
تم تحديد توصيف النسخ الكامل لخلايا فرشاة مجرى الهواء السفلي واستجابتها للمحفزات البيئية بانخفاض أعدادها في ظهارة القصبة الهوائية وأعداد محدودة جدا ً تتجاوز الشعب الهوائية الكبيرة10. التقنيات المستخدمة لعزل الخلايا الحسية الكيميائية من ظهارة الأمعاء لم تسفر عن أعداد عالية نسبيا من القصبة الهوائية، وربما بسبب الاتصالات الحميمة من خلايا فرشاة القصبة الهوائية مع النهايات العصبية10 أو غيرها العوامل الخاصة بالأنسجة في الغشاء المخاطي للجهاز التنفسي مثل تكوين الالتصاق والبروتينات تقاطع ضيق. التقارير الأخيرة عن العزلة الناجحة لخلايا فرشاة القصبة الهوائية بأعداد أعلى لتحليل تسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة تستخدم إما حضانة 2 ح مع الباباين أو حضانة 18 ح مع pronase11,12. منذ أطول الحضانة مع الإنزيمات الهضمية يمكن أن تقلل من قدرة الخلية على البقاء وتغيير الملف الشخصي النسخي للخلايا من الأنسجة المهضومة13، وهذا يمكن أن التحيز التحليل المقارن مع غيرها من السكان الظهارية الحسية الكيميائية.
هنا، ونحن الإبلاغ عن طريقة لعزل خلايا فرشاة القصبة الهوائية لتسلسل RNA3. علاج القصبة الهوائية مع ديسباس جرعة عالية يفصل ظهارة من تحت المخاطية. الهضم اللاحق للورقة الظهارية مع الباباين يسمح لاسترداد ممتاز من هذه الخلية الهيكلية.
Protocol
Representative Results
Discussion
وجدنا أن مزيج من العلاج بجرعة عالية ديسباس لمدة 40 دقيقة تليها علاج البابين قصيرة (30 دقيقة) يوفر بروتوكول الأمثل لهضم القصبة الهوائية وعزل خلايا الفرشاة. هذا المزيج على حد سواء يتجنب الهضم واسعة النطاق وتنتج أعلى عائد من خلايا الفرشاة، مقارنة مع بروتوكولات بديلة.
في حين أن هض…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر آدم تشيكوين في بريغام ومركز المناعة البشرية للمرأة تدفق الأساسية لمساعدته في فرز التدفق الخلوي. وقد دعم هذا العمل المعاهد الوطنية للمنح الصحية R01 HL120952 (N.A.B.), R01 AI134989 (N.A.B), U19 AI095219 (N.A.B., L.G.B)، وK08 AI132723 (L.G.B)، والأكاديمية الأمريكية للحساسية والربو والمناعة (AAAAI)/ حساسية الرئة الأمريكية جائزة أمراض الجهاز التنفسي ،من قبل مؤسسة AAAAI جائزة تطوير أعضاء هيئة التدريس (L.G.B.)، من قبل ستيفن وجودي كاي جائزة المبتكرين الشباب (N.A.B.)، من قبل صندوق جويسلين C. أوستن للتطوير الوظيفي للعلماء الطبيبات (L.G.B.)، و تبرع سخي من قبل عائلة فيك (L.G.B.).
Materials
| Antibodies | |||
| Anti-GFP (Polyclonal goat Ig) | Abcam | cat# ab5450 | |
| APC anti-mouse CD326 (EpCAM) (G8.8) | Biolegend | cat#118214 | |
| APC Rat IgG2a, k isotype control | Biolegend | cat#400511 | |
| DAPI | Biolegend | cat#422801 | |
| Donkey anti-goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Life Technologies/Molecular Probes | cat#A-11055 | |
| Normal Goat IgG | R&D Systems | cat#AB-108-C | |
| Pacific Blue anti-mouse CD45 (30F-11) | Biolegend | cat#103126 | |
| Pacific Blue Rat IgG2b, k isotype control | Biolegend | cat#400627 | |
| TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) Antibody | Biolegend | cat#101320 | |
| Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins | |||
| Dispase | Gibco | cat# 17105041 | |
| DNase I | Sigma | cat# 10104159001 | |
| HEPES-Tyrode’s Buffer Without Calcium (10 mM HEPES, 135 mM NaCl, 2.8 mM KCl, 1 mM MgCl2, 12 mM NaHCO3, 0.4 mM NaH2PO4, 0.25% BSA, 5.5 mM Glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 µm filter | Boston BioProducts | cat# PY-912 | |
| Tyrode’s Solution (HEPES-Buffered) 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 25 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 and 10 mM glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 µm filter. ) | Boston BioProducts | cat# BSS-355 | |
| L-Cysteine | Sigma | cat# C7352 | |
| Leupeptin trifluoroacetate salt | Sigma | cat# L2023 | |
| Papain from papaya latex | Sigma | cat# P3125 | |
| Propidium iodide | Sigma | cat# P4170 | |
| Experimental Models: Organisms/Strains | |||
| ChATBAC-eGFP (B6.Cg-Tg(RP23-268L19-EGFP)2Mik/J) | The Jackson Laboratory | 7902 | |
| Equipment | |||
| LSM 800 with Airyscan confocal system on a Zeiss Axio Observer Z1 Inverted Microscope | Zeiss | ||
| LSRFortessa | BD | 647465 | |
| Disposable equipment | |||
| 1.5 mL sterile tubes | Thomas Scientific | 1157C86 | |
| 5 mL Poysterene Round-bottom Tube, 12 x 75 mm style | Falcon | 14-959-1A | |
| 50 mL Polypropylene conical tube, 30 x 115 mm style | Falcon | 352098 | |
| Feather Disposable Scalpel no.12 | Fisher Scientific | NC9999403 | |
| Petri dish, 100 x 15 mm Style | Falcon | 351029 | |
| Sterile cell strainer, 100 μm | Fisherbrand | cat#22363549 |
References
- Tizzano, M., et al. Nasal chemosensory cells use bitter taste signaling to detect irritants and bacterial signals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (7), 3210-3215 (2010).
- Genovese, F., Tizzano, M. Microvillous cells in the olfactory epithelium express elements of the solitary chemosensory cell transduction signaling cascade. PLoS One. 13 (9), 0202754 (2018).
- Bankova, L. G., et al. The cysteinyl leukotriene 3 receptor regulates expansion of IL-25-producing airway brush cells leading to type 2 inflammation. Science Immunology. 3 (28), (2018).
- Krasteva, G., Canning, B. J., Papadakis, T., Kummer, W. Cholinergic brush cells in the trachea mediate respiratory responses to quorum sensing molecules. Life Sciences. 91 (21-22), 992-996 (2012).
- Nadjsombati, M. S., et al. Detection of Succinate by Intestinal Tuft Cells Triggers a Type 2 Innate Immune Circuit. Immunity. 49 (1), 33-41 (2018).
- von Moltke, J., Ji, M., Liang, H. E., Locksley, R. M. Tuft-cell-derived IL-25 regulates an intestinal ILC2-epithelial response circuit. Nature. 529 (7585), 221-225 (2016).
- Deckmann, K., et al. Bitter triggers acetylcholine release from polymodal urethral chemosensory cells and bladder reflexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8287-8292 (2014).
- Liu, S., et al. Members of Bitter Taste Receptor Cluster Tas2r143/Tas2r135/Tas2r126 Are Expressed in the Epithelium of Murine Airways and Other Non-gustatory Tissues. Frontiers in Physiology. 8, 849 (2017).
- Krasteva, G., et al. Cholinergic chemosensory cells in the auditory tube. Histochemistry and Cell Biology. 137 (4), 483-497 (2012).
- Krasteva, G., et al. Cholinergic chemosensory cells in the trachea regulate breathing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (23), 9478-9483 (2011).
- Montoro, D. T., et al. A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes. Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).
- Plasschaert, L. W., et al. A single-cell atlas of the airway epithelium reveals the CFTR-rich pulmonary ionocyte. Nature. 560 (7718), 377-381 (2018).
- Dwyer, D. F., Barrett, N. A., Austen, K. F. Immunological Genome Project, C. Expression profiling of constitutive mast cells reveals a unique identity within the immune system. Nature Immunology. 17 (7), 878-887 (2016).
- Howitt, M. R., et al. Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut. Science. 351 (6279), 1329-1333 (2016).
- Bankova, L. G., Dwyer, D. F., Liu, A. Y., Austen, K. F., Gurish, M. F. Maturation of mast cell progenitors to mucosal mast cells during allergic pulmonary inflammation in mice. Mucosal Immunology. 8 (3), 596-606 (2015).
- Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
- Rock, J. R., et al. Multiple stromal populations contribute to pulmonary fibrosis without evidence for epithelial to mesenchymal transition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (52), 1475-1483 (2011).
- Gerbe, F., et al. Intestinal epithelial tuft cells initiate type 2 mucosal immunity to helminth parasites. Nature. 529 (7585), 226-230 (2016).
- Rock, J. R., et al. Transmembrane protein 16A (TMEM16A) is a Ca2+-regulated Cl- secretory channel in mouse airways. Journal of Biological Chemistry. 284 (22), 14875-14880 (2009).
- Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues. Molecular and Cellular Proteomics. 3 (6), 608-614 (2004).
- Verma, S., Dixit, R., Pandey, K. C. Cysteine Proteases: Modes of Activation and Future Prospects as Pharmacological Targets. Frontiers in Pharmacology. 7, 107 (2016).
- Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. Journal of Neuroscience. 6 (10), 3044-3060 (1986).
- Kaiser, O., et al. Dissociated neurons and glial cells derived from rat inferior colliculi after digestion with papain. PLoS One. 8 (12), 80490 (2013).
- Aoyagi, T., Takeuchi, T., Matsuzaki, A., Kawamura, K., Kondo, S. Leupeptins, new protease inhibitors from Actinomycetes. Journal of Antibiotics (Tokyo). 22 (6), 283-286 (1969).
- Kohanski, M. A., et al. Solitary chemosensory cells are a primary epithelial source of IL-25 in patients with chronic rhinosinusitis with nasal polyps. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (2), 460-469 (2018).
- Patel, N. N., et al. Solitary chemosensory cells producing interleukin-25 and group-2 innate lymphoid cells are enriched in chronic rhinosinusitis with nasal polyps. International Forum of Allergy & Rhinology. , (2018).
- Kouzaki, H., O’Grady, S. M., Lawrence, C. B., Kita, H. Proteases induce production of thymic stromal lymphopoietin by airway epithelial cells through protease-activated receptor-2. The Journal of Immunology. 183 (2), 1427-1434 (2009).
- Cambier, J. C., Vitetta, E. S., Kettman, J. R., Wetzel, G. M., Uhr, J. W. B-cell tolerance. III. Effect of papain-mediated cleavage of cell surface IgD on tolerance susceptibility of murine B cells. The Journal of Experimental Medicine. 146 (1), 107-117 (1977).
- Nishikado, H., et al. Cysteine protease antigens cleave CD123, the alpha subunit of murine IL-3 receptor, on basophils and suppress IL-3-mediated basophil expansion. Biochemical and Biophysical Research Communications. 460 (2), 261-266 (2015).
