Isolação e avaliação quantitativa de pilhas da escova dos Tracheas do rato
Summary
As pilhas da escova são pilhas epithelial quimiosensoriais colinérgicos raras encontradas na traquéia ingênua do rato. Devido a seus números limitados, a avaliação ex vivo de seu papel funcional na imunidade e na remodelação da via aérea é desafiante. Nós descrevemos um método para a isolação de pilhas tracheal da escova pelo fluxo cytometry.
Abstract
Células da escova traqueal são células epiteliais quimiosensoriais colinérgicas pronta para transmitir sinais do lúmen das vias aéreas para os sistemas imunológico e nervoso. Eles são parte de uma família de células epiteliais quimiosensoriais que incluem células de tufo na mucosa intestinal, células de pincel na traquéia, e células quimiosensoriais e microvillous solitárias na mucosa nasal. As pilhas de chemosensory em compartimentos epithelial diferentes compartilham dos marcadores intracelular chaves e de uma assinatura transcricional do núcleo, mas igualmente para indicar a heterogeneidade transcricional significativa, reflexivo provável do ambiente local do tecido. A isolação de pilhas tracheal da escova das suspensões da única pilha é exigida para definir a função destas pilhas epithelial raras em detalhe, mas seu isolamento é desafiante, potencial devido à interação próxima entre pilhas da escova e terminações de nervo tracheal ou devido à composição da via aérea específica de junções apertadas e aderens. Aqui, nós descrevemos um procedimento para a isolação de pilhas da escova do epitélio tracheal do rato. O método é baseado em uma separação inicial do epitélio tracheal da submucosa, permitindo uma incubação mais curta subseqüente da folha epithelial com Papain. Este procedimento oferece uma solução rápida e conveniente para a classificação citométrica do fluxo e a análise funcional de pilhas tracheal viáveis da escova.
Introduction
As pilhas da escova pertencem a uma classe de pilhas epithelial quimiossensorial caracterizadas pela expressão de receptores amargos do gosto e da maquinaria do transdução do receptor do gosto encontradas em pilhas do botão do gosto. Ao contrário das pilhas do botão do gosto, as pilhas epithelial quimiossensorial são dispersadas em superfícies epithelial e são referidas como pilhas quimiossensorial solitárias (SCCs) e pilhas microvillous no epitélio nasal1,2, pilhas da escova na traqueia 3,4e células de tufo no intestino5,6. Células epiteliais que expressam receptores de paladar amargo e a máquina de transdução de paladar amargo também são encontradas na uretra7,8 e no tubo auditivo9. As pilhas da escova da via aérea têm funções originais em respostas neurogênica e imunes da via aérea. Eles são células quimiosensoriais produtoras de acetilcolina que evocam reflexos respiratórios protetores após a ativação com compostos amargos e metabólitos bacterianos como substâncias que detectam quorum10. As pilhas da escova da via aérea são igualmente a fonte epithelial dominante da via aérea de IL-25, que regula o tipo aeroalergeno-eliciado-2 inflamação nas vias aéreas3.
A caracterização do transcriptoma completo de células de escova de vias aéreas inferiores e sua resposta a estímulos ambientais tem sido limitada por seus baixos números no epitélio traqueal e números muito limitados além dos grandes brônquios10. As técnicas usadas para o isolamento de células quimiosensoriais do epitélio intestinal não produziram números proporcionalmente altos da traquéia, possivelmente por causa dos contatos íntimos de células da escova traqueal com terminações nervosas10 ou outras fatores tecido-específicos na mucosa respiratória tais como a composição de aderens e de proteínas apertadas da junção. Os relatórios recentes da isolação bem sucedida de pilhas tracheal da escova em números mais elevados para a análise de sequenciamento do RNA da única pilha empregou uma incubação de 2 h com papaína ou uma incubação de 18 h com soros11,12. Uma vez que incubações mais longas com enzimas digestivas podem diminuir a viabilidade celular e alterar o perfil transcricional das células dos tecidos digeridos13, isso poderia viés de análise comparativa com outras populações epiteliais quimiosensoriais.
Aqui, nós relatamos um método para a isolação de pilhas tracheal da escova para arranjar em seqüência3do RNA. O tratamento da traquéia com Dispase da elevado-dose separa o epitélio da submucosa. A digestão subseqüente da folha epithelial com papaína permite a recuperação excelente desta pilha estrutural.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nós encontramos que uma combinação de tratamento do Dispase da elevado-dose para o minuto 40 seguido por um tratamento curto do papaína (30 minutos) fornece um protocolo óptimo para a digestão tracheal e a isolação da pilha da escova. Esta combinação evita a digestão extensiva e produz o rendimento o mais elevado de pilhas da escova, comparado aos protocolos alternativos.
Enquanto a digestão pulmonar para extrair células hematopoiéticas classicamente se baseou em enzimas digestiv…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Adam Chicoine no núcleo de fluxo do centro de Imunologia humana da Brigham e da mulher por sua ajuda com a triagem citométrica de fluxo. Este trabalho foi apoiado pelos institutos nacionais de bolsas de saúde R01 HL120952 (N.A.B.), R01 AI134989 (N. A. B), U19 AI095219 (N.A.B., L. G. B), e K08 AI132723 (L. G. B), e pela Academia Americana de alergia, asma e Imunologia (AAAAI)/pulmão americano alérgico Prêmio de doença respiratória (N.A.B.), pelo prêmio de desenvolvimento de professores da Fundação AAAAI (L.G.B.), pelo prêmio Steven e Judy Kaye Young Innovators (N.A.B.), pelo JoYcElYn C. Austen Fund for desenvolvimento de carreira de cientistas de médicos de mulheres (L.G.B.), e por um doação generosa pela família Vinik (L.G.B.).
Materials
| Antibodies | |||
| Anti-GFP (Polyclonal goat Ig) | Abcam | cat# ab5450 | |
| APC anti-mouse CD326 (EpCAM) (G8.8) | Biolegend | cat#118214 | |
| APC Rat IgG2a, k isotype control | Biolegend | cat#400511 | |
| DAPI | Biolegend | cat#422801 | |
| Donkey anti-goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Life Technologies/Molecular Probes | cat#A-11055 | |
| Normal Goat IgG | R&D Systems | cat#AB-108-C | |
| Pacific Blue anti-mouse CD45 (30F-11) | Biolegend | cat#103126 | |
| Pacific Blue Rat IgG2b, k isotype control | Biolegend | cat#400627 | |
| TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) Antibody | Biolegend | cat#101320 | |
| Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins | |||
| Dispase | Gibco | cat# 17105041 | |
| DNase I | Sigma | cat# 10104159001 | |
| HEPES-Tyrode’s Buffer Without Calcium (10 mM HEPES, 135 mM NaCl, 2.8 mM KCl, 1 mM MgCl2, 12 mM NaHCO3, 0.4 mM NaH2PO4, 0.25% BSA, 5.5 mM Glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 µm filter | Boston BioProducts | cat# PY-912 | |
| Tyrode’s Solution (HEPES-Buffered) 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 25 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 and 10 mM glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 µm filter. ) | Boston BioProducts | cat# BSS-355 | |
| L-Cysteine | Sigma | cat# C7352 | |
| Leupeptin trifluoroacetate salt | Sigma | cat# L2023 | |
| Papain from papaya latex | Sigma | cat# P3125 | |
| Propidium iodide | Sigma | cat# P4170 | |
| Experimental Models: Organisms/Strains | |||
| ChATBAC-eGFP (B6.Cg-Tg(RP23-268L19-EGFP)2Mik/J) | The Jackson Laboratory | 7902 | |
| Equipment | |||
| LSM 800 with Airyscan confocal system on a Zeiss Axio Observer Z1 Inverted Microscope | Zeiss | ||
| LSRFortessa | BD | 647465 | |
| Disposable equipment | |||
| 1.5 mL sterile tubes | Thomas Scientific | 1157C86 | |
| 5 mL Poysterene Round-bottom Tube, 12 x 75 mm style | Falcon | 14-959-1A | |
| 50 mL Polypropylene conical tube, 30 x 115 mm style | Falcon | 352098 | |
| Feather Disposable Scalpel no.12 | Fisher Scientific | NC9999403 | |
| Petri dish, 100 x 15 mm Style | Falcon | 351029 | |
| Sterile cell strainer, 100 μm | Fisherbrand | cat#22363549 |
References
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