Isolatie en kwantitatieve evaluatie van de penseel cellen van muis Tracheas
Summary
Penseel cellen zijn zeldzame cholinerge chemosensorische epitheelcellen gevonden in de naïeve muis trachea. Vanwege hun beperkte aantallen is de ex vivo-evaluatie van hun functionele rol in luchtweg-immuniteit en-renovatie een uitdaging. We beschrijven een methode voor isolatie van tracheale penseel cellen door flow cytometrie.
Abstract
Tracheale penseel cellen zijn cholinerge chemosensorische epitheelcellen die zijn geportiseerd om signalen van de luchtweg lumen naar het immuunsysteem en het zenuwstelsel te zenden. Ze zijn onderdeel van een familie van chemosensorische Epitheelcellen, waaronder Tuft cellen in het darmslijmvlies, borstel cellen in de luchtpijp en eenzame chemosensorische en microvillous cellen in het neusslijmvlies. Chemosensorische cellen in verschillende epitheliale compartimenten delen belangrijke intracellulaire markers en een kern transcriptionele handtekening, maar vertonen ook significante transcriptionele heterogeniteit, waarschijnlijk een afspiegeling van de lokale weefsel omgeving. Isolatie van tracheale borstel cellen van enkelvoudige celsuspensies is nodig om de functie van deze zeldzame epitheelcellen gedetailleerd te definiëren, maar hun isolatie is uitdagend, mogelijk als gevolg van de nauwe interactie tussen tracheale borstel cellen en zenuwuiteinden of door luchtweg-specifieke samenstelling van strakke en hecht knooppunten. Hier beschrijven we een procedure voor isolatie van penseel cellen van het tracheale epitheel van de muis. De methode is gebaseerd op een initiële scheiding van tracheaal epitheel van de submucosa, waardoor een daaropvolgende kortere incubatie van het epitheel blad met papaïne mogelijk is. Deze procedure biedt een snelle en gemakkelijke oplossing voor flowcytometrische sortering en functionele analyse van levensvatbare tracheale borstel cellen.
Introduction
Borstel cellen behoren tot een klasse van chemosensorische epitheelcellen gekenmerkt door de uitdrukking van bittere smaak receptoren en de smaak receptor transductie machines gevonden in smaak Bud cellen. In tegenstelling tot smaak Bud cellen, zijn chemosensorische epitheelcellen verspreid in epitheliale oppervlakken en worden aangeduid als eenzame chemosensorische cellen (scc’s) en microvillous cellen in het neus epitheel1,2, borstel cellen in de luchtpijp 3,4en Tuft cellen in de darm5,6. Epitheelcellen die bittere smaak receptoren uitdrukken en de bittere smaak transductie machines zijn ook te vinden in de urethra7,8 en de gehoor buis9. Luchtweg borstel cellen hebben unieke functies in neurogene en immuun luchtweg reacties. Ze zijn acetylcholine-producerende chemosensorische cellen die beschermende respiratoire reflexen oproepen bij activering met bittere verbindingen en bacteriële metabolieten zoals Quorum-sensing stoffen10. Luchtweg borstel cellen zijn ook de dominante luchtweg epitheliale bron van IL-25, die de aeroallergen-opgewekt type 2 ontsteking in de luchtwegen3regelt.
De karakterisering van de volledige transcriptome van lagere luchtweg borstel cellen en hun reactie op milieu stimuli is beperkt door hun lage aantallen in het tracheale epitheel en zeer beperkte aantallen buiten de grote bronchiën10. Technieken die worden gebruikt voor de isolatie van chemosensorische cellen uit het intestinale epitheel hebben niet proportioneel hoge aantallen van de luchtpijp opgeleverd, mogelijk vanwege de intieme contacten van tracheale borstel cellen met zenuwuiteinden10 of andere weefsel-specifieke factoren in de respiratoire mucosa zoals de samenstelling van de aanhangers en nauwe Junction eiwitten. Recente rapporten van succesvolle isolatie van tracheale borstel cellen in hogere aantallen voor single cell RNA sequencing analyse gebruikt ofwel een 2 h incubatie met papaïne of een 18 h incubatie met pronase11,12. Aangezien een langere incubatie met spijsverteringsenzymen de levensvatbaarheid van de cellen kan verminderen en het transcriptionele profiel van cel uit verteerde weefsels13kunnen veranderen, kan dit de vergelijkende analyse met andere chemosensorische epitheel populaties vooroordelen.
Hier rapporteren we een methode voor het isoleren van tracheale borstel cellen voor RNA-sequencing3. Behandeling van de luchtpijp met hoge dosis dispase scheidt het epitheel van de submucosa. Daaropvolgende vertering van het epitheel blad met papaïne zorgt voor een uitstekend herstel van deze structurele cel.
Protocol
Representative Results
Discussion
We constateerden dat een combinatie van een hoge dosis dispase behandeling voor 40 min gevolgd door een korte papaïne behandeling (30 min) een optimaal protocol biedt voor tracheale spijsvertering en borstel celisolatie. Deze combinatie vermijdt uitgebreide spijsvertering en produceert de hoogste opbrengst van penseel cellen, vergeleken met alternatieve protocollen.
Terwijl Long spijsvertering te extract hematopoietische cellen heeft klassiek vertrouwd op milde spijsverteringsenzymen zoals Co…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken Adam Chicoine bij de Brigham and Women’s Human Immunology Center flow core voor zijn hulp bij Flow cytometrische sortering. Dit werk werd gesteund door National Institutes of Health subsidies R01 HL120952 (N.A.B.), R01 AI134989 (N. A. B), U19 AI095219 (N.A.B., L. G. B), en K08 AI132723 (L. G. B), en door de American Academy of Allergy, astma, en Immunologie (AAAAI)/American Long allergische Respiratoire Disease Award (N.A.B.), door de AAAAI Foundation Faculty Development Award (L.G.B.), door de Steven en Judy Kaye Young innovators Award (N.A.B.), door het Fonds Joycelyn C. Austen voor loopbaanontwikkeling van vrouwelijke artsen wetenschappers (L.G.B.), en door een royale donatie van de familie Vinik (L.G.B.).
Materials
| Antibodies | |||
| Anti-GFP (Polyclonal goat Ig) | Abcam | cat# ab5450 | |
| APC anti-mouse CD326 (EpCAM) (G8.8) | Biolegend | cat#118214 | |
| APC Rat IgG2a, k isotype control | Biolegend | cat#400511 | |
| DAPI | Biolegend | cat#422801 | |
| Donkey anti-goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Life Technologies/Molecular Probes | cat#A-11055 | |
| Normal Goat IgG | R&D Systems | cat#AB-108-C | |
| Pacific Blue anti-mouse CD45 (30F-11) | Biolegend | cat#103126 | |
| Pacific Blue Rat IgG2b, k isotype control | Biolegend | cat#400627 | |
| TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) Antibody | Biolegend | cat#101320 | |
| Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins | |||
| Dispase | Gibco | cat# 17105041 | |
| DNase I | Sigma | cat# 10104159001 | |
| HEPES-Tyrode’s Buffer Without Calcium (10 mM HEPES, 135 mM NaCl, 2.8 mM KCl, 1 mM MgCl2, 12 mM NaHCO3, 0.4 mM NaH2PO4, 0.25% BSA, 5.5 mM Glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 µm filter | Boston BioProducts | cat# PY-912 | |
| Tyrode’s Solution (HEPES-Buffered) 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 25 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 and 10 mM glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 µm filter. ) | Boston BioProducts | cat# BSS-355 | |
| L-Cysteine | Sigma | cat# C7352 | |
| Leupeptin trifluoroacetate salt | Sigma | cat# L2023 | |
| Papain from papaya latex | Sigma | cat# P3125 | |
| Propidium iodide | Sigma | cat# P4170 | |
| Experimental Models: Organisms/Strains | |||
| ChATBAC-eGFP (B6.Cg-Tg(RP23-268L19-EGFP)2Mik/J) | The Jackson Laboratory | 7902 | |
| Equipment | |||
| LSM 800 with Airyscan confocal system on a Zeiss Axio Observer Z1 Inverted Microscope | Zeiss | ||
| LSRFortessa | BD | 647465 | |
| Disposable equipment | |||
| 1.5 mL sterile tubes | Thomas Scientific | 1157C86 | |
| 5 mL Poysterene Round-bottom Tube, 12 x 75 mm style | Falcon | 14-959-1A | |
| 50 mL Polypropylene conical tube, 30 x 115 mm style | Falcon | 352098 | |
| Feather Disposable Scalpel no.12 | Fisher Scientific | NC9999403 | |
| Petri dish, 100 x 15 mm Style | Falcon | 351029 | |
| Sterile cell strainer, 100 μm | Fisherbrand | cat#22363549 |
References
- Tizzano, M., et al. Nasal chemosensory cells use bitter taste signaling to detect irritants and bacterial signals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (7), 3210-3215 (2010).
- Genovese, F., Tizzano, M. Microvillous cells in the olfactory epithelium express elements of the solitary chemosensory cell transduction signaling cascade. PLoS One. 13 (9), 0202754 (2018).
- Bankova, L. G., et al. The cysteinyl leukotriene 3 receptor regulates expansion of IL-25-producing airway brush cells leading to type 2 inflammation. Science Immunology. 3 (28), (2018).
- Krasteva, G., Canning, B. J., Papadakis, T., Kummer, W. Cholinergic brush cells in the trachea mediate respiratory responses to quorum sensing molecules. Life Sciences. 91 (21-22), 992-996 (2012).
- Nadjsombati, M. S., et al. Detection of Succinate by Intestinal Tuft Cells Triggers a Type 2 Innate Immune Circuit. Immunity. 49 (1), 33-41 (2018).
- von Moltke, J., Ji, M., Liang, H. E., Locksley, R. M. Tuft-cell-derived IL-25 regulates an intestinal ILC2-epithelial response circuit. Nature. 529 (7585), 221-225 (2016).
- Deckmann, K., et al. Bitter triggers acetylcholine release from polymodal urethral chemosensory cells and bladder reflexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8287-8292 (2014).
- Liu, S., et al. Members of Bitter Taste Receptor Cluster Tas2r143/Tas2r135/Tas2r126 Are Expressed in the Epithelium of Murine Airways and Other Non-gustatory Tissues. Frontiers in Physiology. 8, 849 (2017).
- Krasteva, G., et al. Cholinergic chemosensory cells in the auditory tube. Histochemistry and Cell Biology. 137 (4), 483-497 (2012).
- Krasteva, G., et al. Cholinergic chemosensory cells in the trachea regulate breathing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (23), 9478-9483 (2011).
- Montoro, D. T., et al. A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes. Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).
- Plasschaert, L. W., et al. A single-cell atlas of the airway epithelium reveals the CFTR-rich pulmonary ionocyte. Nature. 560 (7718), 377-381 (2018).
- Dwyer, D. F., Barrett, N. A., Austen, K. F. Immunological Genome Project, C. Expression profiling of constitutive mast cells reveals a unique identity within the immune system. Nature Immunology. 17 (7), 878-887 (2016).
- Howitt, M. R., et al. Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut. Science. 351 (6279), 1329-1333 (2016).
- Bankova, L. G., Dwyer, D. F., Liu, A. Y., Austen, K. F., Gurish, M. F. Maturation of mast cell progenitors to mucosal mast cells during allergic pulmonary inflammation in mice. Mucosal Immunology. 8 (3), 596-606 (2015).
- Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
- Rock, J. R., et al. Multiple stromal populations contribute to pulmonary fibrosis without evidence for epithelial to mesenchymal transition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (52), 1475-1483 (2011).
- Gerbe, F., et al. Intestinal epithelial tuft cells initiate type 2 mucosal immunity to helminth parasites. Nature. 529 (7585), 226-230 (2016).
- Rock, J. R., et al. Transmembrane protein 16A (TMEM16A) is a Ca2+-regulated Cl- secretory channel in mouse airways. Journal of Biological Chemistry. 284 (22), 14875-14880 (2009).
- Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues. Molecular and Cellular Proteomics. 3 (6), 608-614 (2004).
- Verma, S., Dixit, R., Pandey, K. C. Cysteine Proteases: Modes of Activation and Future Prospects as Pharmacological Targets. Frontiers in Pharmacology. 7, 107 (2016).
- Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. Journal of Neuroscience. 6 (10), 3044-3060 (1986).
- Kaiser, O., et al. Dissociated neurons and glial cells derived from rat inferior colliculi after digestion with papain. PLoS One. 8 (12), 80490 (2013).
- Aoyagi, T., Takeuchi, T., Matsuzaki, A., Kawamura, K., Kondo, S. Leupeptins, new protease inhibitors from Actinomycetes. Journal of Antibiotics (Tokyo). 22 (6), 283-286 (1969).
- Kohanski, M. A., et al. Solitary chemosensory cells are a primary epithelial source of IL-25 in patients with chronic rhinosinusitis with nasal polyps. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (2), 460-469 (2018).
- Patel, N. N., et al. Solitary chemosensory cells producing interleukin-25 and group-2 innate lymphoid cells are enriched in chronic rhinosinusitis with nasal polyps. International Forum of Allergy & Rhinology. , (2018).
- Kouzaki, H., O’Grady, S. M., Lawrence, C. B., Kita, H. Proteases induce production of thymic stromal lymphopoietin by airway epithelial cells through protease-activated receptor-2. The Journal of Immunology. 183 (2), 1427-1434 (2009).
- Cambier, J. C., Vitetta, E. S., Kettman, J. R., Wetzel, G. M., Uhr, J. W. B-cell tolerance. III. Effect of papain-mediated cleavage of cell surface IgD on tolerance susceptibility of murine B cells. The Journal of Experimental Medicine. 146 (1), 107-117 (1977).
- Nishikado, H., et al. Cysteine protease antigens cleave CD123, the alpha subunit of murine IL-3 receptor, on basophils and suppress IL-3-mediated basophil expansion. Biochemical and Biophysical Research Communications. 460 (2), 261-266 (2015).
