בידוד והערכה כמותית של תאי המברשת מקנה הנשימה של העכבר
Summary
תאי מברשת הם נדירים cholinergic האפיתל תאים כימוחושי נמצא בקנה הנשימה של העכבר נאיבי. בשל המספרים המוגבלים שלהם, הערכה לשעבר vivo של תפקידם התפקודי בחסינות דרכי הנשימה ושיפוץ הוא מאתגר. אנו מתארים שיטה לבידוד של תאים מברשת קנה הנשימה על ידי הזרמת cy, לנסות.
Abstract
תאי מברשת הקנה הם cholinergic כימוחושי תאים אפיתל צפוי לשדר אותות מן לומן דרכי הנשימה אל מערכות החיסון והעצבים. הם חלק ממשפחה של תאים אפיתל כימוחושי הכוללים תאים קווצת ברירית המעי, תאי מברשת בקנה הנשימה, וכימוחושי בידוד תאים microvillous ברירית האף. כימוחושי תאים בתאי אפיתל שונים לשתף סמנים תאיים מפתח וחתימה ליבה ההמרה, אבל גם להציג משמעותי transcript טרוגניות, כנראה רפלקטיבית של סביבת הרקמה המקומית. בידוד של תאים מברשת הקנה מתוך תא יחיד השבולים נדרש כדי להגדיר את הפונקציה של אלה תאים אפיתל נדירים בפירוט, אבל הבידוד שלהם הוא מאתגר, בגלל האינטראקציה הקרובה בין תאים מברשת קנה הנשימה וקצות העצבים או עקב הרכב ספציפי לדרכי הנשימה של צמתים הדוקים ומחסיד. כאן, אנו מתארים הליך בידוד של תאי מברשת מתוך האפיתל הקנה הנשימה של העכבר. השיטה מבוססת על הפרדה ראשונית של האפיתל קנה הנשימה מן הרירית, המאפשר הדגירה קצר יותר של גיליון האפיתל עם papain. הליך זה מציע פתרון מהיר ונוח עבור מיון cytometric זרימה וניתוח פונקציונלי של תאים מברשת קיימא הקנה.
Introduction
תאי מברשת שייכים מחלקה של תאים אפיתל כימוחושי מאופיין על ידי ביטוי של קולטני טעם המר ואת מכונות קולטן הטעם מצאו בתאים ניצן טעם. בניגוד לטעם ניצן תאים, התאים האפיתל כימופי מפוזרים משטחים אפיתל מכונים תאים כימוחושי הבידוד (sccs) ותאים microvillous ב אפיתל האף1,2, תאי מברשת בקנה הנשימה . תאים 3,4, ו-קווצת במעי5,6 תאים אפיתל ביטוי קולטני טעם המר ואת מכונות טעם המר התמרה גם מצויים בשופכה7,8 ו שפופרת השמיעה9. בתאי מברשת נתיב האוויר יש פונקציות ייחודיות הנוירוגניים ואת התגובה החיסונית החיסון. הם מייצרים אצטילכולין בתאי כימוחושי שעוררו רפלקסים הנשימה הגנה על ההפעלה עם תרכובות מר ומטבוליטים חיידקיים כמו חומרים חישת-quorum10. תאים מברשת נתיב האוויר הם גם מקור האפיתל של דרכי הנשימה הדומיננטי של IL-25, אשר מווסת aeroallergen-מעורר סוג 2 דלקת בדרכי הנשימה3.
אפיון מלוא ההמרה של תאים מברשת האוויר התחתון ואת התגובה שלהם גירויים סביבתיים כבר מוגבל על ידי מספרים נמוכים שלהם באפיתל הקנה ומספרים מוגבלים מאוד מעבר סמפונות גדול10. טכניקות המשמשות לבידוד של תאים כימוחושי מן האפיתל המעי לא הניבו מספרים גבוהים באופן פרופורציונלי מקנה הנשימה, אולי בגלל הקשרים האינטימיים של תאים מברשת הקנה עם קצות העצבים10 או אחרים מרכיבים ספציפיים לרקמה ברירית הנשימה, כגון הרכב של מחסיד וחלבונים הדוקים עם הצומת. דיווחים אחרונים של בידוד מוצלח של תאים מברשת קנה הנשימה במספרים גבוהים יותר עבור ניתוח ה-RNA של תא בודד המועסקים או 2 h דגירה עם פפאין או 18 h הדגירה עם המואז11,12. מאז יותר incubations עם אנזימי העיכול יכול להפחית את הכדאיות התאים ולשנות את הפרופיל הטרנס של תאים מתוך רקמות מתעכל13, זה יכול הטיה ניתוח השוואתי עם אוכלוסיות אפיתל אחרות כימוחושי.
כאן, אנו מדווחים על שיטה לבידוד של תאים מברשת קנה הנשימה ברצף RNA3. טיפול בקנה הנשימה במינון גבוה dispase מפריד את האפיתל מן הרירית. העיכול הבאים של גיליון אפיתל עם פפאין מאפשר התאוששות מצוינת של תא זה מבניים.
Protocol
Representative Results
Discussion
מצאנו כי שילוב של טיפול במינון גבוה dispase עבור 40 דקות ואחריו טיפול פפאין קצר (30 דקות) מספק פרוטוקול אופטימלי לעיכול הקנה ובידוד תא מברשת. שילוב זה גם נמנע מעיכול נרחב ומייצר את התשואה הגבוהה ביותר של תאי מברשת, לעומת פרוטוקולים חלופיים.
בעוד העיכול הריאה לחלץ תאים המטפאות יש ה?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לאדם שכינין במרכז ליבת מרכז האימונולוגיה של הנשים במהלך הסיוע באמצעות מיון ציטומטלי זרימה. עבודה זו נתמכת על ידי המכונים הלאומיים של מענקי בריאות R01 HL120952 (N.A.B.), R01 AI134989 (נ. א. ב), U19 AI095219 (N.A.B., L. G. B), ו K08 AI132723 (L. G. B), ועל ידי האקדמיה האמריקנית לאלרגיה, אסטמה, ואימונולוגיה (ראה)/אמריקן לונג אלרגיות פרס מחלת הנשימה (N.A.B.), על-ידי פרס פיתוח הפקולטה למדעי הקרן (L.G.B.), על ידי הפרס הצעיר של סטיבן וג קיי (N.A.B.), על ידי הקרן לפיתוח קריירה של מדעני נשים (L.G.B.), וב תרומה נדיבה של משפחת ויניק (L.G.B.).
Materials
| Antibodies | |||
| Anti-GFP (Polyclonal goat Ig) | Abcam | cat# ab5450 | |
| APC anti-mouse CD326 (EpCAM) (G8.8) | Biolegend | cat#118214 | |
| APC Rat IgG2a, k isotype control | Biolegend | cat#400511 | |
| DAPI | Biolegend | cat#422801 | |
| Donkey anti-goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Life Technologies/Molecular Probes | cat#A-11055 | |
| Normal Goat IgG | R&D Systems | cat#AB-108-C | |
| Pacific Blue anti-mouse CD45 (30F-11) | Biolegend | cat#103126 | |
| Pacific Blue Rat IgG2b, k isotype control | Biolegend | cat#400627 | |
| TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) Antibody | Biolegend | cat#101320 | |
| Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins | |||
| Dispase | Gibco | cat# 17105041 | |
| DNase I | Sigma | cat# 10104159001 | |
| HEPES-Tyrode’s Buffer Without Calcium (10 mM HEPES, 135 mM NaCl, 2.8 mM KCl, 1 mM MgCl2, 12 mM NaHCO3, 0.4 mM NaH2PO4, 0.25% BSA, 5.5 mM Glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 µm filter | Boston BioProducts | cat# PY-912 | |
| Tyrode’s Solution (HEPES-Buffered) 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 25 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 and 10 mM glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 µm filter. ) | Boston BioProducts | cat# BSS-355 | |
| L-Cysteine | Sigma | cat# C7352 | |
| Leupeptin trifluoroacetate salt | Sigma | cat# L2023 | |
| Papain from papaya latex | Sigma | cat# P3125 | |
| Propidium iodide | Sigma | cat# P4170 | |
| Experimental Models: Organisms/Strains | |||
| ChATBAC-eGFP (B6.Cg-Tg(RP23-268L19-EGFP)2Mik/J) | The Jackson Laboratory | 7902 | |
| Equipment | |||
| LSM 800 with Airyscan confocal system on a Zeiss Axio Observer Z1 Inverted Microscope | Zeiss | ||
| LSRFortessa | BD | 647465 | |
| Disposable equipment | |||
| 1.5 mL sterile tubes | Thomas Scientific | 1157C86 | |
| 5 mL Poysterene Round-bottom Tube, 12 x 75 mm style | Falcon | 14-959-1A | |
| 50 mL Polypropylene conical tube, 30 x 115 mm style | Falcon | 352098 | |
| Feather Disposable Scalpel no.12 | Fisher Scientific | NC9999403 | |
| Petri dish, 100 x 15 mm Style | Falcon | 351029 | |
| Sterile cell strainer, 100 μm | Fisherbrand | cat#22363549 |
References
- Tizzano, M., et al. Nasal chemosensory cells use bitter taste signaling to detect irritants and bacterial signals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (7), 3210-3215 (2010).
- Genovese, F., Tizzano, M. Microvillous cells in the olfactory epithelium express elements of the solitary chemosensory cell transduction signaling cascade. PLoS One. 13 (9), 0202754 (2018).
- Bankova, L. G., et al. The cysteinyl leukotriene 3 receptor regulates expansion of IL-25-producing airway brush cells leading to type 2 inflammation. Science Immunology. 3 (28), (2018).
- Krasteva, G., Canning, B. J., Papadakis, T., Kummer, W. Cholinergic brush cells in the trachea mediate respiratory responses to quorum sensing molecules. Life Sciences. 91 (21-22), 992-996 (2012).
- Nadjsombati, M. S., et al. Detection of Succinate by Intestinal Tuft Cells Triggers a Type 2 Innate Immune Circuit. Immunity. 49 (1), 33-41 (2018).
- von Moltke, J., Ji, M., Liang, H. E., Locksley, R. M. Tuft-cell-derived IL-25 regulates an intestinal ILC2-epithelial response circuit. Nature. 529 (7585), 221-225 (2016).
- Deckmann, K., et al. Bitter triggers acetylcholine release from polymodal urethral chemosensory cells and bladder reflexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8287-8292 (2014).
- Liu, S., et al. Members of Bitter Taste Receptor Cluster Tas2r143/Tas2r135/Tas2r126 Are Expressed in the Epithelium of Murine Airways and Other Non-gustatory Tissues. Frontiers in Physiology. 8, 849 (2017).
- Krasteva, G., et al. Cholinergic chemosensory cells in the auditory tube. Histochemistry and Cell Biology. 137 (4), 483-497 (2012).
- Krasteva, G., et al. Cholinergic chemosensory cells in the trachea regulate breathing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (23), 9478-9483 (2011).
- Montoro, D. T., et al. A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes. Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).
- Plasschaert, L. W., et al. A single-cell atlas of the airway epithelium reveals the CFTR-rich pulmonary ionocyte. Nature. 560 (7718), 377-381 (2018).
- Dwyer, D. F., Barrett, N. A., Austen, K. F. Immunological Genome Project, C. Expression profiling of constitutive mast cells reveals a unique identity within the immune system. Nature Immunology. 17 (7), 878-887 (2016).
- Howitt, M. R., et al. Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut. Science. 351 (6279), 1329-1333 (2016).
- Bankova, L. G., Dwyer, D. F., Liu, A. Y., Austen, K. F., Gurish, M. F. Maturation of mast cell progenitors to mucosal mast cells during allergic pulmonary inflammation in mice. Mucosal Immunology. 8 (3), 596-606 (2015).
- Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
- Rock, J. R., et al. Multiple stromal populations contribute to pulmonary fibrosis without evidence for epithelial to mesenchymal transition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (52), 1475-1483 (2011).
- Gerbe, F., et al. Intestinal epithelial tuft cells initiate type 2 mucosal immunity to helminth parasites. Nature. 529 (7585), 226-230 (2016).
- Rock, J. R., et al. Transmembrane protein 16A (TMEM16A) is a Ca2+-regulated Cl- secretory channel in mouse airways. Journal of Biological Chemistry. 284 (22), 14875-14880 (2009).
- Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues. Molecular and Cellular Proteomics. 3 (6), 608-614 (2004).
- Verma, S., Dixit, R., Pandey, K. C. Cysteine Proteases: Modes of Activation and Future Prospects as Pharmacological Targets. Frontiers in Pharmacology. 7, 107 (2016).
- Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. Journal of Neuroscience. 6 (10), 3044-3060 (1986).
- Kaiser, O., et al. Dissociated neurons and glial cells derived from rat inferior colliculi after digestion with papain. PLoS One. 8 (12), 80490 (2013).
- Aoyagi, T., Takeuchi, T., Matsuzaki, A., Kawamura, K., Kondo, S. Leupeptins, new protease inhibitors from Actinomycetes. Journal of Antibiotics (Tokyo). 22 (6), 283-286 (1969).
- Kohanski, M. A., et al. Solitary chemosensory cells are a primary epithelial source of IL-25 in patients with chronic rhinosinusitis with nasal polyps. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (2), 460-469 (2018).
- Patel, N. N., et al. Solitary chemosensory cells producing interleukin-25 and group-2 innate lymphoid cells are enriched in chronic rhinosinusitis with nasal polyps. International Forum of Allergy & Rhinology. , (2018).
- Kouzaki, H., O’Grady, S. M., Lawrence, C. B., Kita, H. Proteases induce production of thymic stromal lymphopoietin by airway epithelial cells through protease-activated receptor-2. The Journal of Immunology. 183 (2), 1427-1434 (2009).
- Cambier, J. C., Vitetta, E. S., Kettman, J. R., Wetzel, G. M., Uhr, J. W. B-cell tolerance. III. Effect of papain-mediated cleavage of cell surface IgD on tolerance susceptibility of murine B cells. The Journal of Experimental Medicine. 146 (1), 107-117 (1977).
- Nishikado, H., et al. Cysteine protease antigens cleave CD123, the alpha subunit of murine IL-3 receptor, on basophils and suppress IL-3-mediated basophil expansion. Biochemical and Biophysical Research Communications. 460 (2), 261-266 (2015).
