अलगाव और माउस Tracheas से ब्रश कोशिकाओं के मात्रात्मक मूल्यांकन
Summary
ब्रश कोशिकाओं दुर्लभ कोलीनर्जिक chemosensory उपकला कोशिकाओं भोली माउस श्वासनली में पाया जाता है। उनकी सीमित संख्या के कारण, एयरवे प्रतिरक्षा और remodeling में उनकी कार्यात्मक भूमिका के पूर्व vivo मूल्यांकन चुनौतीपूर्ण है. हम प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा श्वासनली ब्रश कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं।
Abstract
Tracheal ब्रश कोशिकाओं कोलीनर्जिक chemosensory उपकला कोशिकाओं प्रतिरक्षा और तंत्रिका तंत्र के लिए airway लुमेन से संकेत संचारित करने के लिए तैयार कर रहे हैं। वे chemosensory उपकला कोशिकाओं के एक परिवार का हिस्सा हैं जो आंतों के श्लेष्म में टफ्ट कोशिकाओं, श्वासनली में ब्रश कोशिकाओं, और नाक के श्लेष्म में एकान्त chemosensory और microvillous कोशिकाओं में शामिल हैं. विभिन्न उपकला डिब्बों में केमोसेंसरी कोशिकाओं कुंजी intracellular मार्करों और एक कोर प्रतिलिपिकरण हस्ताक्षर का हिस्सा है, लेकिन यह भी महत्वपूर्ण प्रतिलिपित्मक विषमता प्रदर्शित, संभावना स्थानीय ऊतक पर्यावरण के चिंतनशील. एकल सेल निलंबन से श्वासनली ब्रश कोशिकाओं के अलगाव के विस्तार में इन दुर्लभ उपकला कोशिकाओं के समारोह को परिभाषित करने के लिए आवश्यक है, लेकिन उनके अलगाव चुनौतीपूर्ण है, संभवतः श्वासनली ब्रश कोशिकाओं और तंत्रिका अंत के बीच करीब बातचीत के कारण या तंग और अनुयायियों जंक्शनों के airway-विशिष्ट संरचना के कारण। यहाँ, हम माउस श्वासनली उपकला से ब्रश कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन. विधि सबम्यूकोसा से श्वासनली उपकला उपकला के प्रारंभिक पृथक्करण पर आधारित है, जिससे पैपिन के साथ उपकला शीट के बाद कम ऊष्मायन के लिए अनुमति दी जाती है। इस प्रक्रिया के प्रवाह cytometric छँटाई और व्यवहार्य श्वासनली ब्रश कोशिकाओं के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए एक तेजी से और सुविधाजनक समाधान प्रदान करता है.
Introduction
ब्रश कोशिकाओं को कड़वा स्वाद रिसेप्टर्स की अभिव्यक्ति और स्वाद रिसेप्टर ट्रांसक्शन मशीनरी स्वाद कली कोशिकाओं में पाया द्वारा विशेषता chemosensory उपकला कोशिकाओं के एक वर्ग से संबंधित हैं। स्वाद कली कोशिकाओं के विपरीत, chemosensory उपकला कोशिकाओं उपकला सतहों में बिखरे हुए हैं और एकान्त chemosensory कोशिकाओं के रूप में संदर्भित कर रहे हैं (SCCs) और नाक उपकला में microvillous कोशिकाओं1,2, श्वासनली में ब्रश कोशिकाओं 3,4, और आंत में गुच्छा कोशिकाओं5,6. कड़वे स्वाद रिसेप्टर्स और कड़वा स्वाद transduction मशीनरी व्यक्त Epithelial कोशिकाओं भी मूत्रमार्ग7,8 और श्रवण ट्यूब9में पाए जाते हैं . एयरवे ब्रश कोशिकाओं neurogenic और प्रतिरक्षा airway प्रतिक्रियाओं में अद्वितीय कार्य किया है. वे acetylcholine उत्पादन chemosensory कोशिकाओं है कि कड़वा यौगिकों और कोरम संवेदन पदार्थों की तरह जीवाणु चयापचयों के साथ सक्रियण पर सुरक्षात्मक श्वसन सजगता पैदा कर रहे हैं10. एयरवे ब्रश सेल भी आईएल-25 के प्रमुख वायुमार्ग उपकला स्रोत हैं, जो वायुमार्ग3में एयरोएलर्जन-एब्ड टाइप 2 सूजन को नियंत्रित करता है।
निम्न वायुमार्ग ब्रश कोशिकाओं के पूर्ण ट्रांसक्रिप्टम की विशेषता और पर्यावरणीय उद्दीपकों के प्रति उनकी प्रतिक्रिया को श्वासनली उपकला में उनकी कम संख्या और बडे ब्रोंची10से परे बहुत सीमित संख्या द्वारा सीमित किया गया है . आंतों के उपकला से रसायन विज्ञान कोशिकाओं के अलगाव के लिए इस्तेमाल की जाने वाली तकनीकों में श्वासनली से आनुपातिक रूप से उच्च संख्या प्राप्त नहीं हुई है, संभवतः तंत्रिका अंत10 या अन्य के साथ श्वासनली ब्रश कोशिकाओं के अंतरंग संपर्कों के कारण श्वसन श्लेष्म में ऊतक-विशिष्ट कारक जैसे कि अनुयायियों और तंग जंक्शन प्रोटीन की संरचना। एकल कोशिका आरएनए अनुक्रमण विश्लेषण के लिए अधिक संख्या में श्वासनली ब्रश कोशिकाओं के सफल अलगाव की हाल की रिपोर्टों में या तो पैपिन के साथ 2 एच ऊष्मायन या प्रोनास11,12के साथ 18 एच ऊष्मायन का प्रयोग किया गया . पाचन एंजाइमों के साथ लंबे समय तक ऊष्मायन सेल व्यवहार्यता को कम करने और पचा ऊतकों से कोशिकाओं की प्रतिलिपि प्रोफ़ाइल को बदल सकते हैं13के बाद से , यह अन्य chemosensory उपकला आबादी के साथ तुलनात्मक विश्लेषण पूर्वाग्रह सकता है.
यहाँ, हम आरएनए अनुक्रमण3के लिए श्वासनली ब्रश कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक विधि की रिपोर्ट. उच्च खुराक के साथ श्वासनली का उपचार उपम्यूकोसा से उपकला को अलग करता है। पैपिन के साथ उपकला शीट के बाद पाचन इस संरचनात्मक सेल के उत्कृष्ट वसूली के लिए अनुमति देता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
हमने पाया है कि 40 मिनट के लिए उच्च खुराक dispase उपचार का एक संयोजन एक छोटी papain उपचार के बाद (30 मिनट) श्वासनली पाचन और ब्रश सेल अलगाव के लिए एक इष्टतम प्रोटोकॉल प्रदान करता है. इस संयोजन दोनों व्यापक पाचन से बचा ज…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम प्रवाह cytometric छँटाई के साथ उसकी मदद के लिए Brigham और महिला मानव इम्यूनोलॉजी सेंटर फ्लो कोर में एडम Chicoine धन्यवाद. यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान संस्थान R01 HL120952 (N.A.B.), R01 AI134989 (N.A.B), U19 AI095219 (N.A.B., द्वारा समर्थित किया गया था L.G.B), और K08 AI132723 (L.G.B), और एलर्जी, अस्थमा, और इम्यूनोलॉजी (AAAAI) / अमेरिकी फेफड़ों एलर्जी के अमेरिकन अकादमी द्वारा श्वसन रोग पुरस्कार (N.A.B.), AAAAI फाउंडेशन संकाय विकास पुरस्कार (L.G.B.) द्वारा, स्टीवन और जूडी काय यंग इनोवेटर्स पुरस्कार (N.A.B.) द्वारा, Joycelyn सी ऑस्टेन फंड द्वारा महिला चिकित्सक वैज्ञानिकों के कैरियर के विकास के लिए (L.G.B.), और एक द्वारा Vinik परिवार (L.G.B.) द्वारा उदार दान.
Materials
| Antibodies | |||
| Anti-GFP (Polyclonal goat Ig) | Abcam | cat# ab5450 | |
| APC anti-mouse CD326 (EpCAM) (G8.8) | Biolegend | cat#118214 | |
| APC Rat IgG2a, k isotype control | Biolegend | cat#400511 | |
| DAPI | Biolegend | cat#422801 | |
| Donkey anti-goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Life Technologies/Molecular Probes | cat#A-11055 | |
| Normal Goat IgG | R&D Systems | cat#AB-108-C | |
| Pacific Blue anti-mouse CD45 (30F-11) | Biolegend | cat#103126 | |
| Pacific Blue Rat IgG2b, k isotype control | Biolegend | cat#400627 | |
| TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) Antibody | Biolegend | cat#101320 | |
| Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins | |||
| Dispase | Gibco | cat# 17105041 | |
| DNase I | Sigma | cat# 10104159001 | |
| HEPES-Tyrode’s Buffer Without Calcium (10 mM HEPES, 135 mM NaCl, 2.8 mM KCl, 1 mM MgCl2, 12 mM NaHCO3, 0.4 mM NaH2PO4, 0.25% BSA, 5.5 mM Glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 µm filter | Boston BioProducts | cat# PY-912 | |
| Tyrode’s Solution (HEPES-Buffered) 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 25 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 and 10 mM glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 µm filter. ) | Boston BioProducts | cat# BSS-355 | |
| L-Cysteine | Sigma | cat# C7352 | |
| Leupeptin trifluoroacetate salt | Sigma | cat# L2023 | |
| Papain from papaya latex | Sigma | cat# P3125 | |
| Propidium iodide | Sigma | cat# P4170 | |
| Experimental Models: Organisms/Strains | |||
| ChATBAC-eGFP (B6.Cg-Tg(RP23-268L19-EGFP)2Mik/J) | The Jackson Laboratory | 7902 | |
| Equipment | |||
| LSM 800 with Airyscan confocal system on a Zeiss Axio Observer Z1 Inverted Microscope | Zeiss | ||
| LSRFortessa | BD | 647465 | |
| Disposable equipment | |||
| 1.5 mL sterile tubes | Thomas Scientific | 1157C86 | |
| 5 mL Poysterene Round-bottom Tube, 12 x 75 mm style | Falcon | 14-959-1A | |
| 50 mL Polypropylene conical tube, 30 x 115 mm style | Falcon | 352098 | |
| Feather Disposable Scalpel no.12 | Fisher Scientific | NC9999403 | |
| Petri dish, 100 x 15 mm Style | Falcon | 351029 | |
| Sterile cell strainer, 100 μm | Fisherbrand | cat#22363549 |
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