Isolamento e valutazione quantitativa delle celle pennello dalle trachea del topo
Summary
Le cellule pennello sono rare cellule epiteliali colinergiche chesidiche che si trovano nella trachea del topo ingenuo. A causa del loro numero limitato, la valutazione ex vivo del loro ruolo funzionale nell’immunità e nel rimodellamento delle vie aeree è impegnativa. Descriviamo un metodo per l’isolamento delle cellule del pennello tracheale dalla citometria di flusso.
Abstract
Le cellule pennello tracheali sono cellule epiteliali colinergiche pronte a trasmettere segnali dal lume delle vie aeree al sistema immunitario e nervoso. Fanno parte di una famiglia di cellule epiteliali chemiosensoriali che includono cellule del ciuffo nella mucosa intestinale, cellule pennello nella trachea, e cellule chemiosensoriali solitarie e microvillous nella mucosa nasale. Le cellule chemiosensoriali in diversi compartimenti epiteliali condividono marcatori intracellulari chiave e una firma trascrizionale di base, ma mostrano anche una significativa eterogeneità trascrizionale, probabilmente riflettente dell’ambiente del tessuto locale. L’isolamento delle cellule del pennello tracheale dalle sospensioni a cella singola è necessario per definire in dettaglio la funzione di queste rare cellule epiteliali, ma il loro isolamento è impegnativo, potenzialmente a causa della stretta interazione tra le cellule del pennello tracheale e le terminazioni nervose o a causa della composizione specifica delle vie aeree di giunzioni strette e aderenti. Qui, descriviamo una procedura per l’isolamento delle cellule pennello dall’epitelio tracheale del topo. Il metodo si basa su una separazione iniziale dell’epitelio tracheale dalla sottomucosa, consentendo una successiva incubazione più breve del foglio epiteliale con papaina. Questa procedura offre una soluzione rapida e conveniente per lo smistamento citometrico del flusso e l’analisi funzionale delle cellule pennello tracheale vitali.
Introduction
Le cellule pennello appartengono a una classe di cellule epiteliali chemiosensoriali caratterizzate dall’espressione di recettori del gusto amaro e dal meccanismo di trasduzione del recettore del gusto presente nelle cellule delle papille gustative. A differenza delle cellule epiteliali chemiosensoriali, le cellule epiteliali chemiosensoriali sono sparse in superfici epiteliali e sono indicate come cellule chemiosensoriali solitarie (SCC) e cellule microvinili nell’epitelio nasale1,2, cellule pennello nel trachea 3,4, e cellule di ciuffo nell’intestino5,6. Le cellule epiteliali che esprimono recettori del gusto amaro eil meccanismo di trasduzione amara si trovano anche nell’uretra 7,8 e nel tubo uditivo9. Le cellule pennello delle vie aeree hanno funzioni uniche nelle risposte neurogeniche e immunitarie delle vie aeree. Sono cellule chemiosensoriali che producono acetilcolina che evocano riflessi respiratori protettivi dopo l’attivazione con composti amari e metaboliti batterici come sostanze di quorum-sensing10. Le cellule pennello delle vie aeree sono anche la fonte epiteliale delle vie aeree di IL-25, che regola l’infiammazione di tipo 2 aeroallergened nelle vie respiratorie3.
La caratterizzazione del trascrittoma completo delle cellule pennello delle vie aeree inferiori e la loro risposta agli stimoli ambientali è stata limitata dal loro basso numero nell’epitelio tracheale e da un numero molto limitato oltre il grande bronchi10. Le tecniche utilizzate per l’isolamento delle cellule chemiosensoriali dall’epitelio intestinale non hanno prodotto numeri proporzionalmente elevati dalla trachea, probabilmente a causa dei contatti intimi delle cellule pennello tracheale con terminazioni nervose10 o altro fattori specifici del tessuto nella mucosa respiratoria come la composizione di aderesi e proteine di giunzione strette. Recenti rapporti di isolamento riuscito delle cellule pennello tracheale in numero maggiore per l’analisi di sequenziamento di RNA a singola cellula hanno impiegato un’incubazione di 2 h con papaina o un’incubazione di 18 h con prosiano11,12. Poiché incubazioni più lunghe con enzimi digestivi possono diminuire la vitalità cellulare e alterare il profilo trascrizionale delle cellule dai tessuti digeriti13, questo potrebbe bias comparativa analisi con altre popolazioni epiteliali chemiosensoriali.
Qui, segnaliamo un metodo per l’isolamento delle cellule del pennello tracheale per il sequenziamento dell’RNA3. Il trattamento della trachea con dispase ad alto dosaggio separa l’epitelio dalla submucosa. La successiva digestione del foglio epiteliale con papaina consente un eccellente recupero di questa cellula strutturale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo scoperto che una combinazione di trattamento dispase ad alta dose per 40 min seguita da un breve trattamento papaina (30 min) fornisce un protocollo ottimale per la digestione tracheale e l’isolamento delle cellule pennello. Questa combinazione evita una digestione estesa e produce la massima resa di celle pennello, rispetto ai protocolli alternativi.
Mentre la digestione polmonare per estrarre le cellule ematopoietiche ha classicamente invocato enzimi digestivi lievi come collagenae I…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Adam Chicoine al Brigham and Women’s Human Immunology Center Flow Core per il suo aiuto con lo smistamento citometrico del flusso. Questo lavoro è stato supportato da National Institutes of Health Grants R01 HL120952 (N.A.B.), R01 AI134989 (N.A.B), U19 AI095219 (N.A.B., L.G.B), e K08 AI132723 (L.G.B), e dall’American Academy of Allergy, Asthma, and Immunology (AAAAI)/ American Lung Allergic Respiratory Disease Award (N.A.B.), del Premio AAAAI Foundation Faculty Development Award (L.G.B.), dello Steven and Judy Kaye Young Innovators Award (N.A.B.), del Joycelyn C. Austen Fund for Career Development of Women Physician Scientists (L.G.B.), e di un generosa donazione da parte della famiglia Vinik (L.G.B.).
Materials
| Antibodies | |||
| Anti-GFP (Polyclonal goat Ig) | Abcam | cat# ab5450 | |
| APC anti-mouse CD326 (EpCAM) (G8.8) | Biolegend | cat#118214 | |
| APC Rat IgG2a, k isotype control | Biolegend | cat#400511 | |
| DAPI | Biolegend | cat#422801 | |
| Donkey anti-goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Life Technologies/Molecular Probes | cat#A-11055 | |
| Normal Goat IgG | R&D Systems | cat#AB-108-C | |
| Pacific Blue anti-mouse CD45 (30F-11) | Biolegend | cat#103126 | |
| Pacific Blue Rat IgG2b, k isotype control | Biolegend | cat#400627 | |
| TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) Antibody | Biolegend | cat#101320 | |
| Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins | |||
| Dispase | Gibco | cat# 17105041 | |
| DNase I | Sigma | cat# 10104159001 | |
| HEPES-Tyrode’s Buffer Without Calcium (10 mM HEPES, 135 mM NaCl, 2.8 mM KCl, 1 mM MgCl2, 12 mM NaHCO3, 0.4 mM NaH2PO4, 0.25% BSA, 5.5 mM Glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 µm filter | Boston BioProducts | cat# PY-912 | |
| Tyrode’s Solution (HEPES-Buffered) 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 25 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 and 10 mM glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 µm filter. ) | Boston BioProducts | cat# BSS-355 | |
| L-Cysteine | Sigma | cat# C7352 | |
| Leupeptin trifluoroacetate salt | Sigma | cat# L2023 | |
| Papain from papaya latex | Sigma | cat# P3125 | |
| Propidium iodide | Sigma | cat# P4170 | |
| Experimental Models: Organisms/Strains | |||
| ChATBAC-eGFP (B6.Cg-Tg(RP23-268L19-EGFP)2Mik/J) | The Jackson Laboratory | 7902 | |
| Equipment | |||
| LSM 800 with Airyscan confocal system on a Zeiss Axio Observer Z1 Inverted Microscope | Zeiss | ||
| LSRFortessa | BD | 647465 | |
| Disposable equipment | |||
| 1.5 mL sterile tubes | Thomas Scientific | 1157C86 | |
| 5 mL Poysterene Round-bottom Tube, 12 x 75 mm style | Falcon | 14-959-1A | |
| 50 mL Polypropylene conical tube, 30 x 115 mm style | Falcon | 352098 | |
| Feather Disposable Scalpel no.12 | Fisher Scientific | NC9999403 | |
| Petri dish, 100 x 15 mm Style | Falcon | 351029 | |
| Sterile cell strainer, 100 μm | Fisherbrand | cat#22363549 |
References
- Tizzano, M., et al. Nasal chemosensory cells use bitter taste signaling to detect irritants and bacterial signals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (7), 3210-3215 (2010).
- Genovese, F., Tizzano, M. Microvillous cells in the olfactory epithelium express elements of the solitary chemosensory cell transduction signaling cascade. PLoS One. 13 (9), 0202754 (2018).
- Bankova, L. G., et al. The cysteinyl leukotriene 3 receptor regulates expansion of IL-25-producing airway brush cells leading to type 2 inflammation. Science Immunology. 3 (28), (2018).
- Krasteva, G., Canning, B. J., Papadakis, T., Kummer, W. Cholinergic brush cells in the trachea mediate respiratory responses to quorum sensing molecules. Life Sciences. 91 (21-22), 992-996 (2012).
- Nadjsombati, M. S., et al. Detection of Succinate by Intestinal Tuft Cells Triggers a Type 2 Innate Immune Circuit. Immunity. 49 (1), 33-41 (2018).
- von Moltke, J., Ji, M., Liang, H. E., Locksley, R. M. Tuft-cell-derived IL-25 regulates an intestinal ILC2-epithelial response circuit. Nature. 529 (7585), 221-225 (2016).
- Deckmann, K., et al. Bitter triggers acetylcholine release from polymodal urethral chemosensory cells and bladder reflexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8287-8292 (2014).
- Liu, S., et al. Members of Bitter Taste Receptor Cluster Tas2r143/Tas2r135/Tas2r126 Are Expressed in the Epithelium of Murine Airways and Other Non-gustatory Tissues. Frontiers in Physiology. 8, 849 (2017).
- Krasteva, G., et al. Cholinergic chemosensory cells in the auditory tube. Histochemistry and Cell Biology. 137 (4), 483-497 (2012).
- Krasteva, G., et al. Cholinergic chemosensory cells in the trachea regulate breathing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (23), 9478-9483 (2011).
- Montoro, D. T., et al. A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes. Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).
- Plasschaert, L. W., et al. A single-cell atlas of the airway epithelium reveals the CFTR-rich pulmonary ionocyte. Nature. 560 (7718), 377-381 (2018).
- Dwyer, D. F., Barrett, N. A., Austen, K. F. Immunological Genome Project, C. Expression profiling of constitutive mast cells reveals a unique identity within the immune system. Nature Immunology. 17 (7), 878-887 (2016).
- Howitt, M. R., et al. Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut. Science. 351 (6279), 1329-1333 (2016).
- Bankova, L. G., Dwyer, D. F., Liu, A. Y., Austen, K. F., Gurish, M. F. Maturation of mast cell progenitors to mucosal mast cells during allergic pulmonary inflammation in mice. Mucosal Immunology. 8 (3), 596-606 (2015).
- Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
- Rock, J. R., et al. Multiple stromal populations contribute to pulmonary fibrosis without evidence for epithelial to mesenchymal transition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (52), 1475-1483 (2011).
- Gerbe, F., et al. Intestinal epithelial tuft cells initiate type 2 mucosal immunity to helminth parasites. Nature. 529 (7585), 226-230 (2016).
- Rock, J. R., et al. Transmembrane protein 16A (TMEM16A) is a Ca2+-regulated Cl- secretory channel in mouse airways. Journal of Biological Chemistry. 284 (22), 14875-14880 (2009).
- Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues. Molecular and Cellular Proteomics. 3 (6), 608-614 (2004).
- Verma, S., Dixit, R., Pandey, K. C. Cysteine Proteases: Modes of Activation and Future Prospects as Pharmacological Targets. Frontiers in Pharmacology. 7, 107 (2016).
- Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. Journal of Neuroscience. 6 (10), 3044-3060 (1986).
- Kaiser, O., et al. Dissociated neurons and glial cells derived from rat inferior colliculi after digestion with papain. PLoS One. 8 (12), 80490 (2013).
- Aoyagi, T., Takeuchi, T., Matsuzaki, A., Kawamura, K., Kondo, S. Leupeptins, new protease inhibitors from Actinomycetes. Journal of Antibiotics (Tokyo). 22 (6), 283-286 (1969).
- Kohanski, M. A., et al. Solitary chemosensory cells are a primary epithelial source of IL-25 in patients with chronic rhinosinusitis with nasal polyps. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (2), 460-469 (2018).
- Patel, N. N., et al. Solitary chemosensory cells producing interleukin-25 and group-2 innate lymphoid cells are enriched in chronic rhinosinusitis with nasal polyps. International Forum of Allergy & Rhinology. , (2018).
- Kouzaki, H., O’Grady, S. M., Lawrence, C. B., Kita, H. Proteases induce production of thymic stromal lymphopoietin by airway epithelial cells through protease-activated receptor-2. The Journal of Immunology. 183 (2), 1427-1434 (2009).
- Cambier, J. C., Vitetta, E. S., Kettman, J. R., Wetzel, G. M., Uhr, J. W. B-cell tolerance. III. Effect of papain-mediated cleavage of cell surface IgD on tolerance susceptibility of murine B cells. The Journal of Experimental Medicine. 146 (1), 107-117 (1977).
- Nishikado, H., et al. Cysteine protease antigens cleave CD123, the alpha subunit of murine IL-3 receptor, on basophils and suppress IL-3-mediated basophil expansion. Biochemical and Biophysical Research Communications. 460 (2), 261-266 (2015).
