نمذجة سرطان الثدي عن طريق حقن داخل القناة من فيروس الغدة الدرقية التعبير عن Cre في الغدة الثديية الماوس
Summary
والهدف من هذا البروتوكول هو وصف نهج جديد لنمذجة سرطان الثدي يستند إلى الحقن داخل القنوات من فيروس الغدة الدرقية الذي يعبر عن Cre في الغدد الثديية للماوس. ويسمح هذا النهج بالتلاعب بالأحداث المسببة للإصابة بالخلايا والأعضاء على حد سواء بطريقة متحكم فيها زمنياً.
Abstract
سرطان الثدي هو مرض غير متجانس، ربما بسبب التفاعلات المعقدة بين خلايا مختلفة من الأصول والأحداث الأورام. نماذج الماوس مفيدة في الحصول على رؤى في هذه العمليات المعقدة. على الرغم من أن العديد من نماذج الماوس قد وضعت لدراسة مساهمات مختلف الأحداث الأورام وخلايا المنشأ لورم الثدي، وهذه النماذج في كثير من الأحيان ليست من نوع الخلية أو عضو محدد أو لا يمكن أن تحفز على بدء التناسل الورم يُمْمَرَك في طريقة تسيطر عليها زمنيا. هنا نقوم بوصف بروتوكول لتوليد نوع جديد من نماذج الماوس سرطان الثدي على أساس الحقن داخل القناة من Cre-التعبير عن الفيروس الغدي (Ad-Cre) في الغدد الثديية الماوس (MGs). بسبب الحقن المباشر من Ad-Cre في القنوات الثديية، وهذا النهج هو MG محددة، دون أي تحريض السرطان غير المرغوب فيها في الأجهزة الأخرى. يمكن إجراء إجراء الحقن داخل القناة في الفئران في مراحل مختلفة من تطور MG (وبالتالي، فإنه يسمح السيطرة الزمنية للتحريض على السرطان، بدءا من ~ 3-4 أسابيع من العمر). يمكن تحقيق خصوصية من نوع الخلية باستخدام مروجين مختلفين من نوع الخلية لدفع تعبير Cre في متجه الأيدينوفيروسي. نُظهر أن الخلايا الظهارية الثديية اللامنية والقاعية (MECs) يمكن استهدافها بإحكام للتلاعب الوراثي القائم على الكِي/اللوكسبي عن طريق حقن داخل القناة من Ad-Cre تحت سيطرة مروج الكيراتين 8 أو كيراتين 5، على التوالي. من خلال دمج مراسل Cre مشروط (على سبيل المثال، Cre/loxP-inducible Rosa26-YFP مراسل)، نبين أن MECs المستهدفة من قبل Ad-Cre، والخلايا السرطانية المشتقة منها، يمكن تتبعها باتباع الخلايا الإيجابية للمراسل بعد الحقن داخل القنوات.
Introduction
الهدف العام لهذه الطريقة هو تطوير نهج جديد لنمذجة سرطان الثدي على أساس حقن داخل القناة من Ad-Cre في MG الماوس. وقد استخدم النهج الوراثي القائم على إعادة التركيب/اللوكسبي على نطاق واسع لنمذجة سرطان الثدي البشري في الفئران. يتم إنشاء الجيل الأول من نماذج الماوس سرطان الثدي القائم على Cre/loxP باستخدام الفئران المعدلة وراثيا ً التي تعبر عن Cre تحت سيطرة المروجين الخاصين بـ MEC (على سبيل المثال، MMTV-Cre لـ MECs الإنارة وجزء من الـ MECs القاعدية وWap-Cre و Blg-Cre للذرية الإنارة وMECs القطيفة، K14-Cre للبازلا وجزء من MECs الإنارة1،2،3،4،5)6، 7 , 8 , 9– ومع ذلك، ففي حين أن هذه الخطوط المعدلة وراثيا التي تعمل في مجال الكر تمكن من التحكم المكاني في التعبير عن الكري (أي في مجموعات فرعية مختلفة من الشركات الصغيرة والمتوسطة)، فإنها لا تسمح بالتحكم الزمني في التعبير عن الكري والتلاعب الجيني بوساطة من الكري/لوكسب. الجيل الثاني من نماذج الماوس سرطان الثدي القائم على Cre/loxP استخدام نهج النشاط/التعبير Cre اللاإمتزاج (على سبيل المثال، استخدام مستقبلات Cre-Estrogen الانصهار [CreER]، والتي يمكن أن تحفز فقط Cre / loxP إعادة تركيب عند إعطاء تاموكسيفين)، و ونتيجة لذلك، تسمح هذه الأدوات الوراثية بكل من الضوابط المكانية والزمنية لتنشيط الأحداث المسببة للسرطان في البلدان المتوسطة الدخل (مثل K8-CreER– وK5-CreERالنماذج القائمة)10و11و12 . في كلا الجيلين من نماذج الماوس سرطان الثدي، كما المروجين تستخدم لدفع التعبير كري أو كرير (على سبيل المثال، Krt8، Krt5)قد تكون نشطة أيضا في الخلايا الظهارية من الأجهزة الأخرى (أي أنها من نوع الخلية ولكن ليس محددة للأعضاء) أو يكون التعبير راشح في أنواع الخلايا غير الخلايا الظهارية (على سبيل المثال، MMTV، التي لديها نشاط راشح في خلايا المكونة للدم نخاع العظام)، وهذه النهج قد يؤدي إلى تطوير السرطان غير المرغوب فيه (ق) في جهاز (أعضاء) أخرى). إذا كانت هذه السرطانات غير المتوقعة تسبب فتكاً في الفئران المصابة، فقد يكون الغرض الأصلي من نمذجة سرطان الثدي في هذه الفئران محظوراً (على سبيل المثال، قد تؤدي الأحداث الأنكسينية التي يقودها MMTV-Creإلى الأورام الخبيثة المكونة للدم والوفاة المبكرة للفئران ، بسبب تسرب المروج MMTV في خلايا المكونة للدم)4.
هنا نبلغ عن نهج نمذجة سرطان الثدي في الفئران التي تسمح على حد سواء من نوع الخلية والجهاز التلاعب محددة من الأحداث oncogenic بطريقة تسيطر عليها زمنيا. ويستند هذا النهج على حقن داخل القنوات من Ad-Cre في MGs الماوس (وبالتالي، هو عضو محدد). يمكن التحكم في التعبير الكري باستخدام مروجين مختلفين خاصين بالسكان من نوع MEC مُدمجين في ناقل الأندينوفيروسي (على سبيل المثال، Krt8 للبلدان المتوسطة الدخل الإنارة، Krt5 لـ MECs القاعدية، وبالتالي تحقيق خصوصية من نوع الخلية). يمكن التحكم في الحث على السرطان في MGs زمنيا عن طريق حقن Ad-Cre في الفئران في أعمار مختلفة، بدءا من 3-4 أسابيع من العمر (البلوغ) إلى مرحلة الكبار.
Protocol
Representative Results
Discussion
نجاح هذا النهج لتحفيز الأورام الثديية من التجمعات السكانية المختلفة من MECs يعتمد ليس فقط على اختيار المروجين مناسبة من نوع الخلية (لدفع التعبير كري) ولكن أيضا على إجراء الحقن داخل القناة نفسها. والفكرة الكامنة وراء هذا النهج هي أن فيروسات Ad-Cre المحقونة يتم الاحتفاظ بها في شجرة القنوات، وهي ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) منحة R01 CA222560 ووزارة الدفاع جائزة اختراق W81XWH-18-1-0037.
Materials
| 33-gauge needle | Hamilton | 7803-05 | point style 3 blunt |
| 7mm Reflex Clip | Braintree Scientific | RF7 CS | |
| Adenovirus, Ad-K5-Cre | University of Iowa Viral Vector Core | Ad5-bk5-Cre (VVC-Berns-1547) | |
| Adenovirus, Ad-K8-Cre | University of Iowa Viral Vector Core | Ad5mK8-nlsCre | |
| Alcohol | Fisher | HC800-1GAL | Prepare to 70% in use |
| biotinylated CD31 | eBiosciences | 13-0311-85 | |
| biotinylated CD45 | eBiosciences | 13-0451-85 | |
| biotinylated TER119 | eBiosciences | 13-5921-85 | |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| CD24-AF-700 | BD Pharmingen | 564237 | |
| CD24-PE | eBiosciences | 12-0242-83 | |
| CD29-APC | eBiosciences | 17-0291-82 | |
| CD29-PE | eBiosciences | 12-0291-82 | |
| Hair Remover Lotion | Nair | 9 Oz | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 7636-01 | 0.025 mL |
| Iodophors | Betadine | 10% Povidone-iodine | |
| Isoflurane | Baxter | NDC 10019-360-40 | 1-2.5% |
| Loxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | 5 mg/ml |
| Lubricant Eye Ointment | Akorn | NDC 17478-062-35 | |
| Micro-dissecting scissors | Pentair | 9M | Watchmaker's Forceps |
| Micro-dissecting tweezers | Dumont | M5 | |
| Taq 5X Master Mix | New England Biolabs | M0285L | |
References
- Wagner, K. U., et al. Cre-mediated gene deletion in the mammary gland. Nucleic Acids Research. 25 (21), 4323-4330 (1997).
- Selbert, S., et al. Efficient BLG-Cre mediated gene deletion in the mammary gland. Transgenic Research. 7 (5), 387-396 (1998).
- Jonkers, J., et al. Synergistic tumor suppressor activity of BRCA2 and p53 in a conditional mouse model for breast cancer. Nature Genetics. 29 (4), 418-425 (2001).
- van Bragt, M. P., Hu, X., Xie, Y., Li, Z. RUNX1, a transcription factor mutated in breast cancer, controls the fate of ER-positive mammary luminal cells. eLife. 3, e03881 (2014).
- Tao, L., van Bragt, M. P., Li, Z. A Long-Lived Luminal Subpopulation Enriched with Alveolar Progenitors Serves as Cellular Origin of Heterogeneous Mammary Tumors. Stem Cell Reports. 5 (1), 60-74 (2015).
- Xu, X., et al. Conditional mutation of Brca1 in mammary epithelial cells results in blunted ductal morphogenesis and tumour formation. Nature Genetics. 22 (1), 37-43 (1999).
- Li, Z., et al. ETV6-NTRK3 fusion oncogene initiates breast cancer from committed mammary progenitors via activation of AP1 complex. Cancer Cell. 12 (6), 542-558 (2007).
- Liu, X., et al. Somatic loss of BRCA1 and p53 in mice induces mammary tumors with features of human BRCA1-mutated basal-like breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (29), 12111-12116 (2007).
- Molyneux, G., et al. BRCA1 basal-like breast cancers originate from luminal epithelial progenitors and not from basal stem cells. Cell Stem Cell. 7 (3), 403-417 (2010).
- Koren, S., et al. PIK3CA induces multipotency and multi-lineage mammary tumours. Nature. 525 (7567), 114-118 (2015).
- Van Keymeulen, A., et al. Reactivation of multipotency by oncogenic PIK3CA induces breast tumour heterogeneity. Nature. 525 (7567), 119-123 (2015).
- Tao, L., Xiang, D., Xie, Y., Bronson, R. T., Li, Z. Induced p53 loss in mouse luminal cells causes clonal expansion and development of mammary tumours. Nature Communications. 8, 14431 (2017).
- Tao, L., van Bragt, M. P. A., Laudadio, E., Li, Z. Lineage Tracing of Mammary Epithelial Cells Using Cell-Type-Specific Cre-Expressing Adenoviruses. Stem Cell Reports. 2 (6), 770-779 (2014).
- Sutherland, K. D., et al. Cell of origin of small cell lung cancer: inactivation of Trp53 and Rb1 in distinct cell types of adult mouse lung. Cancer Cell. 19 (6), 754-764 (2011).
- Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
- The Cancer Genome Atlas Network. Comprehensive molecular portraits of human breast tumours. Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).
- Nik-Zainal, S., et al. The life history of 21 breast cancers. Cell. 149 (5), 994-1007 (2012).
- Abba, M. C., et al. A Molecular Portrait of High-Grade Ductal Carcinoma In Situ. 암 연구학. 75 (18), 3980-3990 (2015).
