通过将表达的腺病毒注射到小鼠乳腺腺中,模拟乳腺癌
Summary
该协议的目的是描述一种新的乳腺癌建模方法,该方法基于将Cre-表达腺病毒注射到小鼠乳腺的电位内。这种方法允许以时间控制的方式对致癌事件进行细胞型和器官特异性操作。
Abstract
乳腺癌是一种异质疾病,可能是由于不同来源细胞和致癌事件之间的复杂相互作用。鼠标模型有助于深入了解这些复杂过程。虽然已经开发了许多小鼠模型来研究各种致癌事件和原源细胞对乳腺肿瘤发生的贡献,但这些模型往往不是细胞型或器官特异性的,或者不能诱导乳腺肿瘤的启动。时间控制的方式。在这里,我们描述了一个协议,以生成一种新型的乳腺癌小鼠模型,基于在电感中注射Cre-表达腺病毒(Ad-Cre)到小鼠乳腺(Mg)。由于直接将 Ad-Cre 注射到乳腺导管中,这种方法是 MG 特异性,在其他器官中没有任何不需要的癌症诱导。内导注射程序可以在小鼠MG发育的不同阶段进行(因此,它允许从3-4周起对癌症诱导进行时间控制)。细胞类型特异性可以通过使用不同的细胞类型特异性启动子来驱动腺病毒载体中的Cre表达。我们表明,在角蛋白8或角蛋白5促进剂的控制下,通过Ad-Cre的内导注射,可以紧紧围绕基于Cre/loxP的基因操作的发光和基底乳腺上皮细胞(MECs)。通过合并有条件的Cre报告器(例如,Cre/loxP诱导的Rosa26-YFP报告),我们表明Ad-Cre所针对的MECs和从它们中提取的肿瘤细胞,可以通过在电内注射后跟踪报告者阳性细胞来追踪。
Introduction
该方法的总体目标是开发一种新的乳腺癌建模方法,该方法基于在小鼠MG中注射Ad-Cre的电位内。基于Cre/loxP重组的遗传方法已被广泛用于模拟小鼠的人类乳腺癌。第一代基于Cre/loxP的乳腺癌小鼠模型是通过使用Cre-表达转基因小鼠在MEC特异性促进因素(例如,发光MEC的MMTV-Cre和部分基础MEC,Wap-Cre和Blg-Cre用于发光祖和阿尔维拉尔发光 MEC,K14-Cre 用于基础和部分灯具 MECs1,2,3,4,5)6,7,8,9.然而,虽然这些Cre转基因线能够对Cre表达进行空间控制(即,在MECs的不同子集中),但它们不允许对Cre表达和Cre/loxP介导的基因操作进行时间控制。第二代基于Cre/loxP的乳腺癌小鼠模型采用诱导的Cre活性/表达方法(例如,使用Cre-雌激素受体融合[CreER],在服用他莫西芬时只能诱导Cre/loxP重组),以及因此,这些遗传工具允许空间和时间控制在MECs(例如,K8-CreER-和K5-CreER为基础的模型)10、11、12中致癌事件的激活.在两代的乳腺癌小鼠模型中,作为驱动Cre或CreER表达的启动子(例如,Krt8,Krt5)也可能活跃在其他器官的上皮细胞中(即,它们是细胞型特异性,但不是器官特异性)或在上皮细胞以外的细胞类型中具有泄漏的表达(例如,MMTV,在骨髓造血细胞中具有泄漏活性),这些方法可能导致其他器官中不需要的癌症的发展。如果这些意外癌症导致受影响的小鼠致命性,则可能禁止对这些小鼠进行乳腺癌建模的最初目的(例如,MMTV-Cre驱动的致癌事件可能导致造血恶性肿瘤和小鼠过早死亡,由于造血细胞中MMTV启动子的泄漏4。
在这里,我们报道了小鼠的乳腺癌建模方法,该方法允许以时间控制的方式对致癌事件进行细胞型和器官特异性操作。这种方法基于将 Ad-Cre 注射到小鼠 MG 中(因此,是特定于器官的)。Cre表达可以通过使用嵌入在腺病毒载体中的不同MEC亚群特异性启动子(例如,Krt8用于发光MEC,Krt5用于基基MEC,从而达到细胞类型特异性)进行控制。通过在不同年龄的小鼠中注射 Ad-Cre,从 3-4 周(青春期)到成人阶段,MG 中的癌症诱导可以暂时控制。
Protocol
Representative Results
Discussion
这种方法从MECs的不同亚群诱导乳腺肿瘤的成功不仅取决于选择适当的细胞型特异性启动子(驱动Cre表达),还取决于电内注射程序本身。这种方法背后的思想是,注入的Ad-Cre病毒被保留在导流明树中,这是一个带有流明的隐蔽结构,因此,只有MEC暴露在病毒中,并且感染了Ad-Cre。由于乳腺管道内的流明空间有限,因此只向每个 MG 注入少量注射混合物非常重要(即 ±3-5 μL)。注射的体积也应根据小鼠的年龄进行?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了美国国家卫生研究院(NIH)授予R01 CA222560和国防部突破奖W81XWH-18-1-0037的支持。
Materials
| 33-gauge needle | Hamilton | 7803-05 | point style 3 blunt |
| 7mm Reflex Clip | Braintree Scientific | RF7 CS | |
| Adenovirus, Ad-K5-Cre | University of Iowa Viral Vector Core | Ad5-bk5-Cre (VVC-Berns-1547) | |
| Adenovirus, Ad-K8-Cre | University of Iowa Viral Vector Core | Ad5mK8-nlsCre | |
| Alcohol | Fisher | HC800-1GAL | Prepare to 70% in use |
| biotinylated CD31 | eBiosciences | 13-0311-85 | |
| biotinylated CD45 | eBiosciences | 13-0451-85 | |
| biotinylated TER119 | eBiosciences | 13-5921-85 | |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| CD24-AF-700 | BD Pharmingen | 564237 | |
| CD24-PE | eBiosciences | 12-0242-83 | |
| CD29-APC | eBiosciences | 17-0291-82 | |
| CD29-PE | eBiosciences | 12-0291-82 | |
| Hair Remover Lotion | Nair | 9 Oz | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 7636-01 | 0.025 mL |
| Iodophors | Betadine | 10% Povidone-iodine | |
| Isoflurane | Baxter | NDC 10019-360-40 | 1-2.5% |
| Loxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | 5 mg/ml |
| Lubricant Eye Ointment | Akorn | NDC 17478-062-35 | |
| Micro-dissecting scissors | Pentair | 9M | Watchmaker's Forceps |
| Micro-dissecting tweezers | Dumont | M5 | |
| Taq 5X Master Mix | New England Biolabs | M0285L | |
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