Raccolta di tessuti di pipistrelli per -Omics Analyses e Primary Cell Culture
Summary
Questo è un protocollo per la preparazione ottimale dei tessuti per analisi genomiche, trascrittomiche e proteomiche di pipistrelli catturati in natura. Esso comprende protocolli per la cattura pipistrello e la dissezione, la conservazione dei tessuti, e la coltura cellulare del tessuto pipistrello.
Abstract
Con l’avanzare delle tecnologie di sequenziamento ad alto consumo, i metodi standardizzati per l’acquisizione e la conservazione di tessuti di alta qualità consentono l’estensione di questi metodi agli organismi non modellati. Una serie di protocolli per ottimizzare la raccolta dei tessuti dai pipistrelli è stata sviluppata per una serie di approcci di sequenziamento ad alta velocità. Qui sono descritti i protocolli per la cattura dei pipistrelli, i dati demografici desiderati da raccogliere per ogni pipistrello e metodi ottimizzati per ridurre al minimo lo stress su un pipistrello durante la raccolta dei tessuti. In particolare sono descritti metodi per la raccolta e il trattamento dei tessuti per ottenere (i) DNA per analisi genomiche ad alto peso molecolare, (ii) RNA per trascrittomi specifici dei tessuti e (iii) proteine per analisi a livello proteomico. Infine, anche delineato è un metodo per evitare il campionamento letale creando colture cellulari primarie praticabili da clip ali. Una motivazione centrale di questi metodi è quella di massimizzare la quantità di potenziali dati molecolari e morfologici per ogni pipistrello e suggerire modi ottimali per preservare i tessuti in modo che mantengano il loro valore man mano che in futuro si sviluppano nuovi metodi. Questa standardizzazione è diventata particolarmente importante con l’emergere di iniziative volte a sequenziare i genomi delle specie a livello cromosomico e privo di errori, in cui sono emerse più parti scientifiche che guidano il sequenziamento di diversi livelli tassonomici, in cui sono emerse più parti scientifiche che guidano il sequenziamento di diversi livelli tassonomici. Gruppi. I protocolli qui descritti definiscono i metodi ideali per la raccolta dei tessuti e la conservazione dei tessuti per Bat1K, il consorzio che sta sequenziando i genomi di ogni specie di pipistrello.
Introduction
I metodi di sequenziamento ad alta velocità (HTS) sono progrediti rapidamente in termini di efficienza e costi ridotti ed è ora possibile scalare questi approcci a centinaia o migliaia di campioni. Le intuizioni ottenute dall’applicazione di queste tecnologie hanno un impatto enorme in diverse discipline scientifiche, dalla biomedicina all’evoluzione e all’ecologia1,2,3. Tuttavia, molte applicazioni HTS si basano in modo critico su acidi nucleici di alta qualità provenienti da una fonte vivente. Questa limitazione è destinata a diventare sempre più problematica con lo sviluppo del sequenziamento di terza generazione basato su molecole di lettura lunga4. Per questi motivi, è necessario concentrare gli sforzi per stabilire le migliori pratiche per la raccolta di campioni di tessuto freschi da organismi selvatici al di fuori del laboratorio, che massimizza l’utilità del materiale e riduce il numero di individui che devono essere raccolto.
Bat1K è un consorzio internazionale di scienziati con un’iniziativa in corso per sequenziare il genoma di ogni specie di bat to cromosomiassembly a livello di cromosomico5. I pipistrelli rappresentano il 20% della diversità dei mammiferi e hanno adattamenti eccezionali che hanno implicazioni per comprendere l’invecchiamento, l’ecologia delle malattie, la biologia sensoriale e il metabolismo5,6. Molti pipistrelli sono anche minacciati o in pericolo a causa dello sfruttamento umano7 o sono in rapido declino a causa di patogeni8,9, e il sequenziamento a livello di genoma è di grande importanza per la conservazione di queste specie. Anche se Bat1K attualmente mira a sequenziare i genomi di tutte le specie di pipistrelli, la standardizzazione della raccolta di campioni di tessuto per il sequenziamento genomico di alta qualità rimane una sfida chiave in tutta la comunità dei biologi dell’organismo. Oltre ai dati genomici, la comprensione funzionale della diversità degli adattamenti dei pipistrelli richiede trascrittoma specifico del tessuto e analisi delle proteine, spesso che richiedono protocolli di raccolta separati. Inoltre, come per tutti i gruppi tassonomici, mentre la raccolta e la conservazione ottimali dei tessuti sono essenziali per ottenere dati di altissima qualità per le analisi -omice, comunicare le migliori pratiche è spesso difficile a causa delle tecnologie in rapida evoluzione e più gruppi di ricerca che lavorano in modo indipendente.
La necessità di adottare le migliori pratiche per la ricerca sui pipistrelli è particolarmente urgente, dato che molte specie di pipistrelli sono rare o minacciate. A differenza di altri piccoli mammiferi come roditori e toporagni, i pipistrelli sono longevi, attribuibili a eccezionali meccanismi di riparazione del DNA10 e riproduzione lenta11, con la maggior parte delle specie che danno alla luce solo uno o (in alcuni casi) due giovani all’anno. Per questi motivi, le popolazioni di pipistrelli possono essere lente a riprendersi dai disturbi, e raccogliere molti individui dal selvaggio non è né consigliabile né fattibile. In altre parole, i protocolli devono essere ottimizzati per ottenere la massima quantità di dati per un singolo campione, riducendo così la necessità di replicare inutilmente gli sforzi di campionamento.
In questo caso, questo protocollo si concentra specificamente sui metodi standardizzati per la raccolta e il campionamento dei tessuti batifori per il sequenziamento genomico e trascrittomico e le analisi delle proteine. La sua priorità assoluta è quella di garantire che i tessuti di pipistrello siano raccolti eticamente e responsabilmente, che vanno dal processo di autorizzazione per la raccolta, all’esportazione dei tessuti alla minimizzazione dello stress verso l’animale e alle condizioni di conservazione a lungo termine. Sono state sviluppate dissezioni elaborate con l’obiettivo di a prova di futuro l’utilità dei diversi materiali raccolti. Questo manoscritto fornisce una guida passo-passo per raccogliere i pipistrelli in modo umano che ha lo scopo di ridurre al minimo l’impatto sulle popolazioni e massimizzare il valore scientifico. Mentre l’obiettivo di questo protocollo è specificamente per l’uso nei pipistrelli, molti dei passaggi sono rilevanti per altri taxa vertebrati, in particolare i mammiferi.
Panoramica della raccolta dei tessuti
La procedura per la raccolta dei tessuti, compresa la temperatura per lo stoccaggio e la scelta dell’agente di conservazione, sarà determinata dalla natura di eventuali analisi a valle pianificate. Tuttavia, si raccomanda vivamente che, quando possibile, il tessuto venga raccolto in una serie di metodi per massimizzare la sua utilità futura anche se non è prevista alcuna analisi specifica. In generale, il tessuto viene raccolto e conservato per le successive analisi degli acidi nucleici (DNA e RNA), o delle proteine. Per ciascuna di queste applicazioni, il tessuto può essere preservato in modo ottimale congelandolo direttamente in azoto liquido (LN2). Tuttavia, l’immersione immediata in LN2 non è sempre possibile sul campo. Con l’avanzare della tecnologia, risorse come fiale specializzate per memorizzare DNA e RNA a temperature ambientali stanno diventando sempre più facilmente disponibili. Anche se non abbiamo convalidato tutti questi materiali in questo protocollo, incoraggiamo altri ricercatori ad analizzare relativamente le prestazioni dei nuovi materiali rispetto a ciò che presentiamo qui. Forniamo metodi per preservare idealmente i tessuti per diverse applicazioni in situazioni in cui LN2 non è accessibile, ad esempio, quando il trasporto LN2 non è possibile a causa dell’accesso al sito tramite piccolo aereo in Amazon. Inoltre, forniamo un metodo per la raccolta del tessuto da cui le cellule vive possono essere coltivate e propagate. Di seguito vengono descritte le considerazioni chiave per la raccolta di materiale per ciascuno di questi rispettivi scopi e una panoramica dei metodi di raccolta è riportata nella Tabella 1.
Tessuto per DNA
Per tutti i tessuti raccolti, il supporto di stoccaggio determinerà se può essere utilizzato per l’estrazione del DNA standard o ad alto peso molecolare (HMW). L’HMW è necessario per il sequenziamento a lunga lettura e attualmente necessario per generare assemblaggi genomici del livello cromosomico, o un genoma “standard di platino”. Il DNA a basso peso molecolare (LMW) può essere estratto dal flash congelato, AllProtect (d’ora in poi indicato come “soluzione stabilizzante del tessuto”), o anche RNAlater (da ora in poi “soluzione di stabilizzazione dell’RNA”) campioni conservati (anche se i campioni congelati flash rimangono ottimali ). Il DNA isolato con metodi di laboratorio standard (ad esempio, colonne di spin della membrana di gel di silice, fenolo-cloroformio), può ancora produrre frammenti di DNA fino a 20 kilobase (kb). Pertanto, a condizione che vi sia una resa sufficiente, questa forma di DNA isolato può essere utilizzata per la preparazione della libreria di dimensioni a inserto singolo, in cui la dimensione dell’inserto è spesso di 500 coppie di base (bp) e vengono generate brevi letture di sequenze di 100bp. Questo DNA è particolarmente utile per progetti di “riconcisio” o studi in cui non sono richiesti dati cromosomici a lunghezza intera. Il DNA HMW (10-150 kb) è più impegnativo e può essere ottenuto in modo affidabile solo utilizzando tessuti che sono stati rapidamente congelati flash in LN2 dopo il raccolto e mantenuti ad un massimo di -80 gradi centigradi fino all’estrazione.
Il peso molecolare basso o il DNA frammentato sono spesso sufficienti per approcci mirati, tra cui l’amplificazione genica tramite PCR e il sequenziamento a lettura breve13. Indagini basate su PCR utilizzando DNA LMW che prendono di mira solo uno o pochi geni sono stati altamente informativi nella comprensione dell’adattamento e dell’evoluzione molecolare della biologia sensoriale dei pipistrelli6,14, fisiologia15, la filogenetica 5,16, e conservazione17,18. È stata inoltre dimostrata una riuscita riconquista di sequenze mirate di basso peso molecolare e DNA frammentato per numerosi gruppi di vertebrati, tra cui i pipistrelli19. Questi metodi sono spesso convenienti e minimamente invasivi per il pipistrello, poiché campioni fecali e campionamento di tessuti non letali tramite tamponi buccali o punzoni di biopsia delle ali sono anche modi comuni per ottenere il DNA per analisi a basso peso molecolare20, 21.
Tuttavia, la qualità dipende fortemente dal tipo di supporto in cui è memorizzato il campione22. Dopo confronti sistematici e quantitativi di tamponi bucchi e punzoni biopsia, è stato dimostrato che i punzoni per biopsia delle ali producono livelli di DNA costantemente più elevati ed erano meno stressanti per il pipistrello durante la raccolta22. Questi confronti hanno anche mostrato che i migliori risultati sono stati ottenuti quando il punzone alare è stato conservato in silice indicatore (cioè, un tipo di desiccante fatto di perline di gel di silice che cambia colore quando si osserva l’umidità) piuttosto che in altri supporti di stoccaggio popolari come etanolo o DMSO22; anche se non sono stati esaminati altri supporti di memorizzazione, tra cui la soluzione di stabilizzazione dei tessuti. I pugni ali possono essere utilizzati anche per far crescere le cellule fibroblaste nella coltura, come in Kacprzyk et al.23 e come descritto di seguito (vedere la sezione 6). Per questi metodi, l’ala o l’uropatagium devono essere estesi delicatamente e per ottenere il campione deve essere utilizzato un punzone di biopsia pulito, in genere di 3 mm di diametro. Questo approccio sembra non causare danni duraturi, con cicatrici che guariscono entro settimane nella maggior parte dei casi24.
Il DNA HMW (10-150 kb) è più impegnativo ed è attualmente ottenuto solo in modo affidabile utilizzando tessuto che è stato rapidamente congelato flash in LN2 dopo il raccolto e mantenuto ad un massimo di -80 gradi centigradi fino all’estrazione. Il DNA HMW (10-150 kb) è fondamentale per il sequenziamento del DNA a lunga lettura e quindi per l’assemblaggio del genoma de novo. Infatti, mentre la maggior parte dei kit commerciali può essere utilizzata per isolare alcuni DNA HMW standard, le dimensioni delle molecole risultanti spesso non soddisfano i requisiti delle tecnologie di sequenziamento di terza generazione [ad esempio, quelle lanciate da aziende come Pacific Biosciences (PacBio), Oxford Nanopore Technologies, e 10x Genomica, o attraverso metodi di assemblaggio offerti da Bionano Genomics o Dovetail Genomics]. Come tale, c’è una nuova domanda di DNA “ultra HMW” (>150 kb). Quando si ottiene ultra HMW DNA da pipistrelli, campioni freschi di fegato, cervello, o muscolo sono tutti adatti, ma questi devono essere immediatamente flash congelati in LN2 senza alcun buffer di stoccaggio o crioprotectant. Una descrizione completa di questi passaggi esula dall’ambito di questo documento, ma sono disponibili altrove25.
Tessuto per RNA
L’RNA è una molecola a filamento singolo che è meno stabile del DNA. Sebbene esistano molte forme di RNA, le analisi -omiche tendono a concentrarsi sull’mRNA (RNA messaggero) e sui piccoli RNA (ad esempio, i microRNA). Dopo la trascrizione, l’mRNA viene unito per formare una trascrizione matura che non contiene introni e rappresenta la porzione di codifica di geni/genomi. I geni codificanti rappresentano una piccola frazione della dimensione del genoma (1%-2%), rendendo l’mRNA mirato un mezzo conveniente per ottenere dati di sequenza per i geni. I microRNA sono una classe di RNA che regolano il processo di traduzione dell’mRNA nelle proteine e sono quindi importanti fattori normativi. Le trascrizioni dell’RNA possono essere sequenziate singolarmente, o più comunemente per le analisi -omiche26,27,28,29,30, come parte di un trascrittoma; vale a dire, il totale di tutte le trascrizioni di RNA presenti in un dato campione.
Il sequenziamento può essere eseguito seguendo diversi metodi (ad esempio, tramite RNA-seq a lettura breve o seq isoforme intero a lettura prolungata), consentendo l’analisi sia dell’abbondanza di RNA che dell’uso isoforme. Poiché la quantità e la diversità delle trascrizioni dell’mRNA variano tra cellule e tessuti, il sequenziamento dell’RNA consente di studiare e confrontare l’espressione e la regolazione genica tra i campioni. Cresce l’interesse per il sequenziamento di piccoli RNA e il sequenziamento isoforme intero, poiché questi metodi stanno diventando sempre più biologicamente informativi. La preparazione di campioni di tessuto per sequenziare diverse classi di RNA può essere eseguita nello stesso modo presentato in questo manoscritto, con solo i metodi di estrazione successivi diversi31,32. Infine, poiché i trascrittomi offrono un sottoinsieme ad alta copertura del genoma codificante delle proteine, il set di dati assemblato può essere utile nell’assemblaggio e nell’annotazione del genoma, rendendo la raccolta di dati RNA-seq in una serie di tessuti diversi un componente importante del Iniziativa Bat1K.
A differenza del DNA, l’RNA è chimicamente instabile e anche preso di mira dagli enzimi RNae, che sono onnipresentismente presenti nei lismi tisati come strategia difensiva contro i virus basati sull’RNA. Per questi motivi, la frazione di RNA nelle cellule e nei tessuti inizia a degradarsi poco dopo il punto di campionamento e/o eutanasia. Conservare l’RNA richiede quindi dei passi per prevenirne la degradazione. Questo in genere comporta la conservazione del tessuto appena raccolto a 4 gradi in un agente stabilizzante come la soluzione di stabilizzazione dell’RNA per inattivare le RNane naturalmente presenti nei tessuti, seguita dal congelamento per lo stoccaggio a lungo termine. Come alternativa preferita, il tessuto può essere congelato flash in LN2; anche se come osservato in precedenza, il trasporto di LN2 sul campo e il mantenimento dei livelli per prevenire lo scongelamento dei tessuti può essere logisticamente impegnativo.
Tessuto per proteine
La composizione delle proteine e l’abbondanza relativa variano tra le cellule e i tessuti in modo simile a quello discusso per l’RNA; tuttavia, le proteine sono in media più stabili dell’RNA. L’identificazione delle proteine con la proteomica in genere corrisponde a una frazione della sequenza proteica e non all’intera, ma può fornire informazioni sull’espressione tra i tessuti e caratterizzare gli agenti patogeni presenti. Poiché molte sequenze proteiche sono conservate tra i mammiferi, i campioni di pipistrello per la proteomica possono essere facilmente contaminati da proteine umane conservate, richiedendo protocolli sterili (ad esempio, guanti, pinze) durante la raccolta. Mentre il congelamento dei flash in LN2 è il modo migliore per prevenire la degradazione delle proteine, l’uso di ghiaccio secco, congelatori -20 gradi centigradi e persino il ghiaccio sono adatti se non ci sono altri mezzi. Con l’aumentare delle temperature, aumenta anche il rischio di ripartizione differenziale delle proteine. Gli agenti stabilizzanti come la soluzione di stabilizzazione dei tessuti sono efficaci nel preservare la frazione proteica dei tessuti a temperatura ambiente e sono adatti per la conservazione a breve termine (fino a una settimana) quando il flash-congelamento non è praticabile.
Il profilo enzimatico di un dato tessuto influenza direttamente la conservazione delle proteine in esso contenuto. Tessuti a bassa attività ezimatica come il muscolo possono preservare i profili proteici anche alle temperature più elevate in un congelatore domestico. Al contrario, il tessuto epatico è enzimaticamente reattivo e le sue proteine hanno maggiori probabilità di degradare durante la preparazione. Il crescente numero di protocolli per ottenere profili proteomici umani da campioni di paraffina -embedded (FFPE) fissati in formalina suggerisce che il fissaggio della paraformaldeide dei tessuti promette per la conservazione delle proteine a basso costo quando il congelamento al momento della raccolta non è fattibile33,34. Sebbene fortemente dipendenti dai tempi e dalle condizioni di conservazione, le proteine sono state identificate tramite immunohistochimica da esemplari di pipistrelli fissati in formalina e conservati con etanolo35. Questo approccio non è scalabile per il campionamento a livello proteomico, ma evidenzia il potenziale dei tessuti pipistrello fissati in formalina per produrre profili proteici quando il congelamento flash non è disponibile e altri agenti stabilizzanti sono troppo costosi.
Tessuti per coltura cellulare
Il campionamento del tessuto e il flash-congelamento offrono una quantità finita di materiale da utilizzare, e una volta che il materiale viene utilizzato, non è più disponibile. In alternativa, le colture cellulari forniscono cellule vive che possono essere immediatamente utilizzate o conservate per studi futuri. Le colture facilitano anche l’espansione delle cellule per aumentare la resa quando i campioni di tessuto sono piccoli. È particolarmente utile nei casi in cui la raccolta dei tessuti è limitata, come gli esperimenti con specie rare in cui il campionamento non letale è essenziale e ha quindi ampie implicazioni per la conservazione. Descritto è un protocollo in cui la coltura cellulare è possibile attraverso il campionamento non letale del tessuto della membrana alare, ma la coltura è possibile con più tipi di tessuto36,37. Il protocollo qui fornito seleziona per le cellule aderenti. La combinazione di tessuto di origine e mezzi di crescita utilizzati rende questo protocollo adatto a selezionare e far crescere i fibroblasti, ma se lo si desidera, protocolli alternativi possono essere utilizzati per selezionare per altri tipi di cellule. Nel contesto del progetto Bat1K, si prevede che per le specie rare e minacciate, il campionamento non letale di membrane alari e l’espansione dei campioni attraverso la coltura sia essenziale per generare il volume di DNA necessario per le molteplici tecnologie impiegate5 .
Cattura bat
Tutte le persone che maneggiano i pipistrelli devono essere addestrate da un ricercatore competente e vaccinate contro la rabbia con una serie di iniezioni pre-esposizione. Se morso, è ancora necessaria un’ulteriore serie di iniezioni post-esposizione. I metodi standard per l’acquisizione dei pipistrelli includono le reti di nebbia (Figura 1) e le trappole dell’arpa (Figura 2). Le reti a nebbia sono più comunemente utilizzate e ideali per le aree con un’attività da bassa a moderata, in quanto richiedono la massima cura per ridurre al minimo il disagio del pipistrello. I pipistrelli piccoli sono particolarmente vulnerabili e possono morire a fini di stress se non tendono rapidamente. Frequenti ispezioni nette riducono al minimo le lesioni e la mortalità dei pipistrelli, nonché i danni alla rete nebbiosa. Questo dettaglio è importante perché una corretta raccolta dei tessuti richiede che il tessuto sia fresco, e un’attenzione impropria alle reti della nebbia nei pipistrelli può portare a mortalità non necessaria o mortalità prematura prima che il ricercatore possa elaborare correttamente i campioni. Poiché diversi pipistrelli possono riposare in una trappola per arpa con disagio minimo, questo approccio è ideale per le aree con un’elevata attività dei pipistrelli, come vicino a una grotta o a un grande posatoio. Istruzioni dettagliate per una corretta cattura dei pipistrelli e l’elaborazione dei dati per la raccolta di informazioni morfologiche e demografiche sono disponibili nei metodi supplementari.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo discusso in questo manoscritto descrive le migliori pratiche di campionamento per varie analisi molecolari ad alto throughput di pipistrelli. Tutti gli studi -omics di successo richiedono tessuto di alta qualità, ma il campionamento del tessuto pipistrello, così come altri organismi non modellati, si verifica spesso in condizioni di campo che non possono essere fissate agli stessi standard di quelli di un ambiente di laboratorio controllato. Il campionamento avviene spesso in postazioni remote, con risors…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Centro de Ecologàa y Biodiversidad CEBIO, Erika Paliza, Miluska Sonchez, Jorge Carrera, Edgar Rengifo Visquez, Harold Porocarrero sarria, Jorge Ruàz Leveau, Jaime Pecheco Castillo, Carlos Tello, il tessuto Fanny Cornejo e Fanny Fernànez Melo per la realizzazione di raccolta in Perù possibile. Ringraziamo anche tutti i membri del Grupo Jaragua e di Yolanda Leàn per aver reso possibile la raccolta dei tessuti nella Repubblica Dominicana, così come a Bernal Rodriguez Hernandez, Bernal Matarrita, e tutti alla Stazione di Ricerca Biologica La Selva in Costa Rica, per aver reso campionamento possibile. Ringraziamo Ella Lattenkamp & Lutz Wiegrebe per l’accesso e la raccolta di campioni di punzoni sulle ali di Phyllostomus scolorire i pipistrelli per la generazione della coltura cellulare. Phyllostomus scolorire pipistrelli provenienti da una colonia riproduttiva nel Dipartimento Biologia II del Ludwig-Maximilians-Università di Monaco. L’ottenimento e la rivasa dei pipistrelli è stato rilasciato dall’ufficio veterinario del distretto di Monaco. LMD, SJR, KTJD e LRY sono stati finanziati da NSF-DEB 1442142. LMD è stato finanziato da NSF-DEB 1838273. LRY è stato finanziato dalla NSF-PRFB 1812035. SCV e PD sono stati finanziati da un Max Planck Research Group Award e da una borsa di ricerca Human Frontiers Science Program (HFSP) Research (RGP0058/2016). SJR, JHTP e KTJD sono stati finanziati dal Consiglio europeo della ricerca (ERC Starting grant 310482 [EVOGENO]) assegnato al SJR, ECT è stato finanziato dalla sovvenzione del Consiglio europeo della ricerca (ERC-2012-StG311000).
Materials
| 1.5 mL Eppendorf Safelock tubes | Fischer Scientific | 10509691 | 1.5 mL sterile tubes used during cell culture protocol |
| 15 mL tubes | Sarstedt | 62,554,002 | 15 mL sterile tubes used during cell culture protocol |
| 2 mL cryovials | Thomas Scientific | 1154P75 | cryogenic vials for tissues to be stored in liquid nitrogen |
| 3-mm biopsy punch | Medline | MIL3332 | wing biopsy punch for cell culture |
| 6 well plate | Greiner | 83,392 | Culture vessle |
| Allprotect Tissue Reagent | Qiagen | 76405 | for fecal samples; tissue stabilizing solution |
| Cell counting slides for TC10/TC20 cell counter, dual chamber | Bio-Rad | 145-0011 | Chambers for the count cells using the automated cell counter TC20 by Bio-Rad |
| collagenase IV | Stemcell Technologies | 7909 | For dissociation of primary cells |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650-5X5ML | Prevents crystalization of water during freezing of the cells. |
| DMEM–Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher | 12491-015 | culture media |
| Dulbecco's PBS | Invitrogen | 14190169 | Balanced salt solution used for washing cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Fischer Scientific | 10270106 | Serum-supplement for in vitro cell culture of eukaryotic cells |
| Gentamycin sulfate salt | Sigma Aldrich | G1264-250MG | Antibiotic for culture media |
| Nalgene Mr. Frosty | Thermo Scientific | 5100-0050 | Freezing container which provides 1°C/min cooling rate |
| PARAFILM | Sigma | P7793 | Wrapping tubes etc for sealing |
| Penicillin-streptomycin (pen-strep), 100x | Invitrogen | 15140130 | Antibiotic for culture media |
| Phosphate-buffered saline (PBS) 10x, pH 7.4 | Thermo Fisher | 10010023 | salt buffer used for washes and storage of bone tissue; dilute to 10X using de-ionized water |
| RNAlater | Thermo Fisher | AM7021 | RNA stabilizing solution |
| RNAse away | Genetech | 83931-250mL | breaks down enzymes that lead to RNA degradation |
| Silica gel | Fisher Scientific | 7631-86-9 | dessicant agent |
| TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | 1450102 | Automated cell counter |
| Trypan blue | Bio-Rad | 145-0013 | Cell stain used to assess cell viability |
| trypsin-EDTA | Sigma Aldrich | T4049 | For dissociation of cells during splitting |
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