Ткань Коллекция летучих мышей для -Омики анализ и первичной культуры клеток

Summary

Это протокол для оптимальной подготовки тканей для геномных, транскриптомических и протеомных анализов летучих мышей, пойманных в дикой природе. Она включает в себя протоколы для захвата летучих мышей и вскрытия, сохранения тканей, и клеточной культивирования ткани летучих мышей.

Abstract

По мере продвижения технологий секвенирования высокой пропускной способности стандартизированные методы приобретения и сохранения тканей высокого качества позволяют распространить эти методы на немоделированные организмы. Для ряда подходов к секвенированию высокой пропускной способности была разработана серия протоколов для оптимизации сбора тканей летучих мышей. Здесь описаны протоколы для захвата летучих мышей, желаемой демографии, которые будут собраны для каждой летучей мыши, и оптимизированные методы, чтобы свести к минимуму нагрузку на летучую мышь во время сбора тканей. Конкретно изложены методы сбора и лечения тканей для получения (i) ДНК для геномного анализа высокого молекулярного веса, (ii) РНК для транскриптомов, специфических тканей, и (iii) белков для протеомического уровня анализа. Наконец, также изложен ы метод, чтобы избежать смертельной выборки путем создания жизнеспособных первичных культур клеток из крыла клипов. Центральной мотивацией этих методов является максимизация количества потенциальных молекулярных и морфологических данных для каждой летучей мыши и предложить оптимальные способы сохранения тканей, чтобы они сохраняли свою ценность по мере развития новых методов в будущем. Эта стандартизация стала особенно важной, поскольку появились инициативы по секвенированию хромосомного уровня, безошибочным геномам видов во всем мире, в которых несколько научных партий возглавляют секвенирование различных таксономических Группы. Протоколы, изложенные в настоящем проекте, определяют идеальные методы сбора тканей и сохранения тканей для Bat1K, консорциума, который секвенирует геномы каждого вида летучих мышей.

Introduction

Методы секвенирования высокой пропускной способности (HTS) быстро продвинулись в эффективности и снизили стоимость, и теперь можно масштабировать эти подходы до сотен или тысяч образцов. Исследования, полученные в результате применения этих технологий имеют огромное влияние на несколько научных дисциплин, от биомедицины до эволюции и экологии^1,2,3. Тем не менее, многие приложения HTS в решающей степени полагаются на высококачественные нуклеидные кислоты из живого источника. Это ограничение, вероятно, будет становиться все более проблематичным с развитием секвенирования третьего поколения на основе долгочитаемых молекул^4. По этим причинам необходимо сосредоточить усилия на установлении наилучшей практики сбора образцов свежих тканей диких организмов за пределами лаборатории, что максимизирует полезность материала и сокращает число лиц, которые должны быть Собранные.

Bat1K является международным консорциумом ученых с постоянной инициативой по последовательности генома каждого вида летучих мышей на уровне хромосом сборки⁵. Летучие мыши представляют 20% разнообразия млекопитающих и имеют исключительные адаптации, которые имеют последствия для понимания старения, экологии заболеваний, сенсорной биологии и метаболизма^5,6. Многие летучие мыши также находятся под угрозой или находятся под угрозой из-за эксплуатации человека⁷ или быстро снижается из-за патогенных микроорганизмов^8,9, и секвенирование на уровне генома имеет большое значение для сохранения этих видов. Хотя Bat1K в настоящее время направлена на секвенирование геномов всех видов летучих мышей, стандартизация сбора образцов тканей для высококачественного геномного секвенирования остается ключевой проблемой для сообщества биологов организмов. В дополнение к геномным данным, функциональное понимание разнообразия адаптации летучих мышей требует анализа транскриптома и белка, часто требующего отдельных протоколов сбора. Кроме того, как и во всех таксономических группах, в то время как оптимальный сбор и сохранение тканей имеет важное значение для получения данных о высшем качестве для анализа -омики, передача передового опыта часто затруднена из-за быстро меняющихся технологий и несколько исследовательских групп, работающих независимо друг от начала.

Необходимость внедрения передовой практики для исследований летучих мышей особенно актуальна, учитывая, что многие виды летучих мышей встречаются редко или находятся под угрозой. В отличие от других мелких млекопитающих, таких как грызуны и землеройки, летучие мыши являются долгоживущими, что объясняется исключительными механизмами репарации ДНК¹⁰ и медленным размножением^11,при этом большинство видов рожают только одного или (в некоторых случаях) двух молодых в год. По этим причинам, летучие мыши населения может быть медленным, чтобы оправиться от беспорядков, и сбор многих людей из дикой природы не является ни целесообразным, ни возможным. Другими словами, протоколы должны быть оптимизированы для получения максимального объема данных для одного образца, что снизит необходимость излишней репликации усилий по отбору проб.

Здесь этот протокол конкретно посвящен стандартизированным методам сбора и отбора проб тканей летучих мышей для геномного и транскриптомического секвенирования и анализа белка. Его главным приоритетом является обеспечение того, чтобы ткани летучих мышей собирались этически и ответственно, начиная от процесса выдачи разрешений на сбор, экспорта тканей и минимизируя стресс животному, и длительные условия хранения. Разработаны сложные вскрытия с целью будущей проверки полезности различных собранных материалов. Данная рукопись представляет собой пошаговое руководство по сбору летучих мышей гуманным способом, которое призвано свести к минимуму воздействие на население и максимизировать научную ценность. Хотя в центре внимания этого протокола специально для использования в летучих мышей, многие шаги имеют отношение к другим позвоночных таксон, особенно млекопитающих.

Обзор коллекции тканей
Процедура сбора тканей, включая температуру для хранения и выбор консервирующего агента, будет определяться характером запланированных анализов. Тем не менее, настоятельно рекомендуется, чтобы, когда это возможно, ткани собираются в рамках целого ряда методов, чтобы максимизировать свою будущую полезность, даже если не планируется конкретный анализ. В целом, ткани собираются и сохраняются для последующего анализа либо нуклеиновых кислот (ДНК и РНК), либо белка. Для каждого из этих применений ткани могут быть оптимально сохранены путем прямого замораживания вспышки в жидком азоте (LN2). Тем не менее, немедленное погружение в LN2 не всегда возможно в поле. По мере развития технологий ресурсы, такие как специализированные флаконы для хранения ДНК и РНК при температурах окружающей среды, становятся все более доступными. Хотя мы не подтвердили все такие материалы в этом протоколе, мы призываем других исследователей сравнительно проанализировать производительность новых материалов относительно того, что мы представляем здесь. Мы предоставляем методы для идеального сохранения ткани для различных приложений в ситуациях, когда LN2 не может быть доступна, например, когда LN2 транспорт не представляется возможным из-за доступа к сайту через небольшой самолет в Амазонии. Кроме того, мы предоставляем метод сбора тканей, из которых можно выращивать и размножаться живые клетки. Ниже мы излагаем основные соображения для сбора материалов для каждой из этих целей и обзор методов сбора приведен в таблице 1.

Ткань для ДНК
Для всех собранных тканей, средства хранения будут определять, если он может быть использован для стандартного или высокого молекулярного веса (HMW) ДНК экстракции. HMW необходим для длительного секвенирования и в настоящее время требуется для генерации сборок генома уровня хромосомы, или генома “платинового стандарта”. Низкомолекулярный вес (LMW) ДНК могут быть извлечены из флэш-замороженных, AllProtect (отныне называют “ткани стабилизирующий раствор”), или даже РНК-стабилизатор (отсюда “РНК стабилизирующий раствор”) сохраненные образцы (хотя флэш замороженные образцы остаются оптимальными ). ДНК, выделенная стандартными лабораторными методами (например, колонны шпиненок кремнезема геля, фенол-хлороформ), все еще может давать фрагменты ДНК до 20 килобаз (кб). Таким образом, при наличии достаточной урожайности, эта форма изолированной ДНК может быть использована для подготовки библиотеки размером одной вставки, в которой размер вставки часто составляет 500 базовых пар (bp), а короткая последовательность считывает 100 bp, генерируется^12. Эта ДНК особенно полезна для “резеконно-редактирующих” проектов или исследований, в которых полноразмерные хромосомные данные не требуются. ДНК HMW (10-150 кб) является более сложной и может быть надежно получена только с помощью ткани, которая была быстро флэш-заморожена в LN2 после сбора урожая и поддерживается на максимуме -80 градусов по Цельсию до экстракции.

Низкий молекулярный вес или фрагментированная ДНК часто достаточна для целевых подходов, включая усиление генов с помощью ПЦР и краткое секвенирование^13. ПЦР основе исследований с использованием ДНК LMW, которые нацелены только один или несколько генов были весьма информативными в понимании адаптации и молекулярной эволюции летучих мышей сенсорной биологии^6,14, физиологии¹⁵, филогенетики ^5,16, и сохранение^17,18. Успешное целевое последовательность повторного захвата низкой молекулярной массы и фрагментированной ДНК также было продемонстрировано для многочисленных групп позвоночных, в том числе летучих мышей¹⁹. Эти методы часто экономически эффективными и минимально инвазивных летучих мышей, как фекальные образцы и нелетальной ткани выборки через buccal тампоны или крыла биопсии удары также общие способы получения ДНК для анализа низкого молекулярного веса^{20, 21}.

Тем не менее, качество сильно зависит от типа носителей, в которых хранится образец^22. После систематических и количественных сравнений буккальных тампонов и бипсии биопсии, крыло биопсии удары были показаны, чтобы дать последовательно более высокие уровни ДНК и были менее напряженными для летучей мыши во время сбора²². Эти сравнения также показали, что лучшие результаты были получены, когда крыло удар был сохранен в индикатор кремнезема (т.е. тип desiccant из сварлийного геля бисера, который меняет цвет, когда влага наблюдается), а не в других популярных средств хранения, таких как этанол или DMSO²²; хотя, другие средства хранения, включая решение стабилизации тканей, не были изучены. Удары крыла можно также использовать для того чтобы вырасти клетки fibroblast в культуре, such as в Kacprzyk et al.²³ и как описано ниже (см. раздел 6). Для этих методов, крыло или uropatagium должны быть расширены мягко, и чистый удар биопсии, как правило, 3 мм в диаметре, должны быть использованы для получения образца. Этот подход, как представляется, не вызывают прочного ущерба, со шрамами заживления в течение нескольких недель в большинстве случаев²⁴.

ДНК HMW (10-150 кб) является более сложной и в настоящее время только надежно получены с помощью ткани, которая была быстро флэш заморожены в LN2 после сбора урожая и поддерживается на максимуме -80 градусов по Цельсию до экстракции. ДНК HMW (10-150 кб) имеет решающее значение для длительного секвенирования ДНК и, следовательно, для сборки генома de novo. Действительно, в то время как большинство коммерческих комплектов могут быть использованы для изоляции некоторых стандартных ДНК HMW, в результате размеры молекул часто не отвечают требованиям технологий секвенирования третьего поколения, например, тех, которые были запущены такими компаниями, как Pacific Biosciences (PacBio), Оксфорд Нанопор технологий, и 10x геномики, или с помощью методов сборки, предлагаемых Bionano Genomics или Dovetail Genomics. Таким образом, существует новый спрос на ДНК “ultra HMW” (Зтт;150 кб). При получении ультра HMW ДНК из летучих мышей, свежие образцы печени, мозга или мышц все подходят, но они должны быть немедленно флэш заморожены в LN2 без каких-либо буфера хранения или криопротектора. Полное описание этих шагов выходит за рамки настоящего документа, но доступны в других²⁵.

Ткань для РНК
РНК представляет собой одноцепочечную молекулу, которая менее стабильна, чем ДНК. Хотя существует много форм РНК, анализы-омики, как правило, сосредоточены на мРНК (мессенджер РНК) и малых РНК (например, микроРНК). После транскрипции мРНК сращивается, образуя зрелый транскрипт, который не содержит интронов и представляет собой кодирующую часть генов/геномов. Гены кодирования составляют крошечную долю размера генома (1%-2%), что делает таргетинг мРНК экономически эффективным средством получения данных о последовательности генов. МикроРНК представляют собой класс РНК, которые регулируют процесс перевода мРНК в белки и, таким образом, являются важными регуляторными эффекторами. РНК транскрипты могут быть секвенированы индивидуально, или чаще для -омики анализы^{26,27,28,29,30}, как часть транскриптома; то есть, в общей сложности все транскрипты РНК, присутствующие в данной выборке.

Секвенирование может быть выполнено с помощью нескольких методов (т.е. с помощью короткого чтения РНК-сек или долгочитания всего изоформы Seq), что позволяет анализировать как изобилие РНК, так и использование изоформ. Поскольку количество и разнообразие транскриптов мРНК варьируется между клетками и тканями, секвенирование РНК позволяет изучать и сравнивать экспрессию генов и регулирование в различных образцах. Растет интерес к секвенированию малых РНК и целому изоформированию, поскольку эти методы становятся все более биологически информативными. Подготовка образцов тканей к последовательности различных классов РНК может быть выполнена таким же образом, как представлено в данной рукописи, и только последующие методы извлечения отличаются^31,32. Наконец, поскольку транскриптомы предлагают высокий охват подмножество генома кодирования белка, собранный набор данных может быть полезен в сборке и аннотации генома, что делает сбор данных РНК-сек в различных тканях важным компонентом Инициатива Bat1K.

В отличие от ДНК, РНК химически нестабильна, а также ориентирована на ферменты RNase, которые повсеместно присутствуют в лизатах тканей в качестве оборонительной стратегии против РНК-вирусов. По этим причинам фракция РНК в клетках и тканях начинает деградировать вскоре после момента отбора проб и/или эвтаназии. Таким образом, сохранение РНК требует принятия мер по предотвращению ее деградации. Это обычно включает в себя сохранение свежесобранной ткани при температуре 4 градусов по Цельсию в стабилизирующем агенте, таком как РНК стабилизирующий раствор для инактивирования RNases, естественно присутствующих в тканях, а затем замораживание для долгосрочного хранения. В качестве предпочтительной альтернативы, ткани могут быть флэш-замороженных в LN2; хотя, как отмечалось выше, транспортировка LN2 в поле и поддержание уровней для предотвращения таяния тканей может быть логистически сложной задачей.

Ткань для белка
Состав белка и относительное изобилие различаются между клетками и тканями по аналогии с тем, что обсуждалось для РНК; однако, белки в среднем более стабильны, чем РНК. Идентификация протеинов с использованием протеомики обычно соответствует фракции, а не всей последовательности белков, но она может предоставить информацию о экспрессии в тканях и охарактеризовать присутствующие патогенные микроорганизмы. Поскольку многие белковые последовательности сохраняются среди млекопитающих, образцы летучих мышей для протеомики могут быть легко загрязнены консервированными человеческими белками, требующими стерильных протоколов (например, перчатки, щипцы) во время сбора. В то время как флэш-замораживание в LN2 является лучшим способом предотвратить деградацию белков, использование сухого льда, -20 qC морозильники, и даже лед подходят, если нет других средств. По мере повышения температуры повышается и риск дифференциального распада белка. Стабилизирующие средства, такие как решение стабилизации тканей, эффективны в сохранении белковой фракции тканей при комнатной температуре и подходят для кратковременного сохранения (до одной недели), когда замораживание вспышки нежизнеспособно.

Ферментативный профиль данной ткани непосредственно влияет на сохранение белка в ней. Ткани с низкой ферментативной активностью, такие как мышцы, могут сохранять белковые профили даже при более высоких температурах в бытовой морозильной камере. В отличие от этого, ткань печени ферментативно реактивна, и ее белки имеют более высокую вероятность деградации во время подготовки. Растущее число протоколов для получения протеомических профилей человека из формально-фиксированных парафина встроенных (FFPE) образцов предполагает, что параформальдегид фиксации тканей обещает для недорогой сохранения белка при замораживании при сборе не является возможно^33,34. Хотя сильно зависит от времени сохранения и состояния, белки были определены с помощью иммуногистохимии от формилина фиксированной, этанол-сохраненные образцы летучей мыши³⁵. Этот подход не масштабируется для протеомного уровня выборки, но подчеркивает потенциал для формилина фиксированной ткани летучих мышей для получения белковых профилей, когда флэш-замораживания недоступна и другие стабилизирующие агенты являются слишком дорогостоящими.

Ткань для клеточной культуры
Отбор проб ткани и флэш-замораживания предлагает конечное количество материала, который будет использоваться, и как только материал используется, он больше не доступен. Кроме того, клеточные культуры обеспечивают живые клетки, которые могут быть немедленно использованы или сохранены для будущих исследований. Культуры также способствуют расширению клеток, чтобы увеличить урожайность, когда образцы тканей малы. Это особенно полезно в тех случаях, когда сбор тканей ограничен, например эксперименты с редкими видами, в которых нелетальный отбор проб имеет важное значение и, следовательно, имеет широкие последствия для сохранения. Описанный протокол, в котором клеточная культура возможна с помощью нелетального отбора проб ткани мембраны крыла, но культивирование возможно с несколькими типами тканей^36,37. Протокол, представленный здесь, выбирает для адептов ячейки. Сочетание исходной ткани и используемых носителей роста делает этот протокол подходящим для выбора и выращивания фибробластов, но при желании, альтернативные протоколы могут быть использованы для выбора для других типов клеток. В контексте проекта Bat1K прогнозируется, что для редких и находящихся под угрозой исчезновения видов нелетальный отбор проб оболочек крыла и расширение образцов через культивирование имеет важное значение для создания объема ДНК, необходимого для нескольких технологий, используемых⁵ .

Захват летучих мышей
Все люди обработки летучих мышей должны быть обучены летучей мыши компетентный исследователь и вакцинированы против бешенства с серией предварительного воздействия инъекций. Если укусил, еще ряд послеэкспозиционных инъекций по-прежнему необходимо. Стандартные методы для захвата летучих мышей включают туман сетей(рисунок 1) и арфы ловушки(рисунок 2). Туманные сети наиболее часто используются и идеально подходят для районов с низкой и умеренной активностью, так как они требуют наибольшей заботы для минимизации дистресса летучих мышей. Малые летучие мыши особенно уязвимы и могут умереть от стресса, если не, как правило, быстро. Частые чистые инспекции свести к минимуму травмы летучих мышей и смертности, а также повреждения сетки тумана. Эта деталь важна потому что правильная коллекция ткани требует ткани быть свежей, и неправильное внимание к сетям тумана в летучих мышей может вести к ненужной смертности или преждевременной смертности прежде чем исследователь может правильно обработать образцы. Поскольку несколько летучих мышей могут отдыхать в арфистовой ловушке с минимальным исчисляемым диагнозом, этот подход идеально подходит для районов с высокой активностью летучих мышей, таких как возле пещеры или большого насест. Подробные инструкции по надлежащему захвату летучих мышей и обработке данных для сбора морфологической и демографической информации доступны в дополнительных методах.

Protocol

Все описанные здесь методы были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) Университета Стоуни-Брук (протокол #2013-2034). 1. Эвтаназия Смочите ватный шарик с изофрураном анестезии или другой доступной анестезии. Поместите ватн…

Representative Results

ДнкДля анализа низкого молекулярного веса (LMW) ДНК была извлечена из трех видов неотропических летучих мышей. Образцы тканей были собраны в поле из Доминиканской Республики и Коста-Рики в соответствии с протоколами, описанными в настоящем документе. После в…

Discussion

В протоколе, обсуждаемом в данной рукописи, описываются лучшие методы отбора проб для различных высокопроизводительных молекулярных анализов летучих мышей. Все успешные исследования требуют высокого качества тканей, но отбор проб тканей летучих мышей, а также других немодельных орга…

Materials

1.5 mL Eppendorf Safelock tubes	Fischer Scientific	10509691	1.5 mL sterile tubes used during cell culture protocol
15 mL tubes	Sarstedt	62,554,002	15 mL sterile tubes used during cell culture protocol
2 mL cryovials	Thomas Scientific	1154P75	cryogenic vials for tissues to be stored in liquid nitrogen
3-mm biopsy punch	Medline	MIL3332	wing biopsy punch for cell culture
6 well plate	Greiner	83,392	Culture vessle
Allprotect Tissue Reagent	Qiagen	76405	for fecal samples; tissue stabilizing solution
Cell counting slides for TC10/TC20 cell counter, dual chamber	Bio-Rad	145-0011	Chambers for the count cells using the automated cell counter TC20 by Bio-Rad
collagenase IV	Stemcell Technologies	7909	For dissociation of primary cells
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	D2650-5X5ML	Prevents crystalization of water during freezing of the cells.
DMEM–Dulbecco's Modified Eagle Medium	Thermo Fisher	12491-015	culture media
Dulbecco's PBS	Invitrogen	14190169	Balanced salt solution used for washing cells
Fetal bovine serum (FBS)	Fischer Scientific	10270106	Serum-supplement for in vitro cell culture of eukaryotic cells
Gentamycin sulfate salt	Sigma Aldrich	G1264-250MG	Antibiotic for culture media
Nalgene Mr. Frosty	Thermo Scientific	5100-0050	Freezing container which provides 1°C/min cooling rate
PARAFILM	Sigma	P7793	Wrapping tubes etc for sealing
Penicillin-streptomycin (pen-strep), 100x	Invitrogen	15140130	Antibiotic for culture media
Phosphate-buffered saline (PBS) 10x, pH 7.4	Thermo Fisher	10010023	salt buffer used for washes and storage of bone tissue; dilute to 10X using de-ionized water
RNAlater	Thermo Fisher	AM7021	RNA stabilizing solution
RNAse away	Genetech	83931-250mL	breaks down enzymes that lead to RNA degradation
Silica gel	Fisher Scientific	7631-86-9	dessicant agent
TC20 Automated Cell Counter	Bio-Rad	1450102	Automated cell counter
Trypan blue	Bio-Rad	145-0013	Cell stain used to assess cell viability
trypsin-EDTA	Sigma Aldrich	T4049	For dissociation of cells during splitting