Colección de tejidos de murciélagos para análisis de émica y cultivo celular primario
Summary
Este es un protocolo para la preparación óptima del tejido para análisis genómicos, transcriptómicos y proteómicos de murciélagos atrapados en la naturaleza. Incluye protocolos para la captura y disección de murciélagos, la preservación de tejidos y el cultivo celular del tejido murciélago.
Abstract
A medida que avanzan las tecnologías de secuenciación de alto rendimiento, los métodos estandarizados para la adquisición y preservación de tejidos de alta calidad permiten la extensión de estos métodos a organismos no modelo. Se ha desarrollado una serie de protocolos para optimizar la recolección de tejidos de murciélagos para una serie de enfoques de secuenciación de alto rendimiento. Aquí se describen los protocolos para la captura de murciélagos, los datos demográficos deseados que se recogerán para cada murciélago y los métodos optimizados para minimizar el estrés en un murciélago durante la recolección de tejido. Específicamente se describen los métodos para recolectar y tratar tejido para obtener (i) ADN para análisis genómicos de alto peso molecular, (ii) ARN para transcriptomas específicos del tejido y (iii) proteínas para análisis de nivel proteómico. Por último, también se describe un método para evitar el muestreo letal mediante la creación de cultivos celulares primarios viables a partir de clips de alas. Una motivación central de estos métodos es maximizar la cantidad de datos moleculares y morfológicos potenciales para cada murciélago y sugerir formas óptimas de preservar los tejidos para que conserven su valor a medida que se desarrollen nuevos métodos en el futuro. Esta normalización se ha vuelto particularmente importante a medida que han surgido iniciativas para secuenciar genomas de especies a nivel de cromosomas y libres de errores en todo el mundo, en los que múltiples partes científicas están encabezando la secuenciación de diferentes taxonómicos Grupos. Los protocolos descritos aquí definen los métodos ideales de recolección de tejidos y preservación de tejidos para Bat1K, el consorcio que está secuenciando los genomas de cada especie de murciélago.
Introduction
Los métodos de secuenciación de alto rendimiento (HTS) han avanzado rápidamente en eficiencia y han disminuido en costos, y ahora es posible escalar estos enfoques a cientos o miles de muestras. Las perspectivas obtenidas por la aplicación de estas tecnologías tienen enormes impactos en múltiples disciplinas científicas, desde la biomedicina hasta la evolución y la ecología1,2,3. Sin embargo, muchas aplicaciones de HTS dependen críticamente de los ácidos nucleicos de alta calidad de una fuente viva. Es probable que esta limitación se vuelva cada vez más problemática con el desarrollo de la secuenciación de tercera generación basada en moléculas de lectura larga4. Por estas razones, es necesario centrar los esfuerzos en establecer las mejores prácticas para la recolección de muestras de tejido fresco de organismos silvestres fuera del laboratorio, lo que maximiza la utilidad del material y reduce el número de individuos que necesitan ser Recogidos.
Bat1K es un consorcio internacional de científicos con una iniciativa continua para secuenciar el genoma de cada especie de murciélago en el conjunto a nivel cromosómico5. Los murciélagos representan el 20% de la diversidad de mamíferos y tienen adaptaciones excepcionales que tienen implicaciones para entender el envejecimiento, la ecología de enfermedades, la biología sensorial y el metabolismo5,6. Muchos murciélagos también están amenazados o en peligro debido a la explotación humana7 o están disminuyendo rápidamente debido a patógenos8,9,y la secuenciación a nivel del genoma es de gran importancia para la conservación de estas especies. Aunque Bat1K actualmente tiene como objetivo secuenciar los genomas de todas las especies de murciélagos, la estandarización de la recolección de muestras de tejido para la secuenciación genómica de alta calidad sigue siendo un desafío clave en toda la comunidad de biólogos del organismo. Además de los datos genómicos, la comprensión funcional de la diversidad de adaptaciones de murciélagos requiere transcriptoma de tejidos específicos y análisis de proteínas, a menudo que requieren protocolos de recolección separados. Además, al igual que con todos los grupos taxonómicos, si bien la recolección y conservación óptima de tejidos es esencial para obtener los datos de la más alta calidad para los análisis de la omics, la comunicación de las mejores prácticas a menudo es difícil debido a los cambios rápidos en las tecnologías y múltiples equipos de investigación trabajando de forma independiente.
La necesidad de adoptar las mejores prácticas para la investigación de murciélagos-omics es especialmente urgente, dado que muchas especies de murciélagos son raras o amenazadas. A diferencia de otros pequeños mamíferos como roedores y musarañas, los murciélagos son de larga duración, atribuibles a mecanismos excepcionales de reparación del ADN10 y la reproducción lenta11,con la mayoría de las especies dando a luz a sólo una o (en algunos casos) dos crías al año. Por estas razones, las poblaciones de murciélagos pueden ser lentas para recuperarse de las perturbaciones, y recoger a muchos individuos de la naturaleza no es aconsejable ni factible. En otras palabras, los protocolos deben optimizarse para obtener la máxima cantidad de datos para una sola muestra, lo que reduce la necesidad de replicar innecesariamente los esfuerzos de muestreo.
Aquí, este protocolo se centra específicamente en métodos estandarizados para la recolección y muestreo de tejido murciélago para la secuenciación genómica y transcriptomica y análisis de proteínas. Su principal prioridad es garantizar que los tejidos del murciélago se recojan de forma ética y responsable, desde el proceso de permiso para la recolección, la exportación de tejidos hasta la minimización del estrés al animal y las condiciones de almacenamiento a largo plazo. Se han desarrollado disecciones elaboradas con el objetivo de probar el futuro la utilidad de los diferentes materiales recogidos. Este manuscrito proporciona una guía paso a paso para recoger murciélagos de una manera humana que está destinada a minimizar el impacto en las poblaciones y maximizar el valor científico. Si bien el enfoque de este protocolo es específicamente para su uso en murciélagos, muchos de los pasos son relevantes para otros taxones vertebrados, especialmente los mamíferos.
Resumen de la colección de tejidos
El procedimiento para la recolección de tejidos, incluida la temperatura de almacenamiento y la elección del agente conservante, se determinará por la naturaleza de los análisis posteriores previstos. Sin embargo, se recomienda encarecidamente que, cuando sea posible, el tejido se recoja bajo una serie de métodos para maximizar su utilidad futura, incluso si no se planea ningún análisis específico. En general, el tejido se recoge y conserva para análisis posteriores de ácidos nucleicos (ADN y ARN) o proteínas. Para cada una de estas aplicaciones, el tejido se puede conservar de forma óptima mediante la congelación directa del flash en nitrógeno líquido (LN2). Sin embargo, la inmersión inmediata en LN2 no siempre es posible en el campo. A medida que avanza la tecnología, recursos como viales especializados para almacenar ADN y ARN a temperaturaambiente son cada vez más fácilmente disponibles. Aunque no hemos validado todos estos materiales en este protocolo, animamos a otros investigadores a analizar comparativamente el rendimiento de los nuevos materiales en relación con lo que presentamos aquí. Proporcionamos métodos para preservar idealmente el tejido para diferentes aplicaciones en situaciones en las que no se puede acceder a LN2, por ejemplo, cuando el transporte LN2 no es posible debido al acceso al sitio a través de un pequeño plano en el Amazonas. Además, proporcionamos un método para la recolección de tejido del que se pueden cultivar y propagar células vivas. A continuación describimos las consideraciones clave para la recopilación de material para cada uno de estos propósitos respectivos y se ofrece una visión general de los métodos de recogida en el Cuadro 1.
Tejido para ADN
Para todo el tejido cosechado recogido, el medio de almacenamiento determinará si se puede utilizar para la extracción de ADN estándar o de alto peso molecular (HMW). HMW es necesario para la secuenciación de lectura larga y actualmente se requiere para generar conjuntos de genomas de nivel cromosómico, o un genoma “estándar de platino”. El ADN de bajo peso molecular (LMW) se puede extraer de muestras congeladas por flash, AllProtect (en adelante denominada “solución estabilizadora de tejidos”), o incluso muestras conservadas por RNAlater (en adelante “solución estabilizadora de ARN”) (aunque las muestras congeladas con flash siguen siendo óptimas ). El ADN aislado por métodos de laboratorio estándar (p. ej., columnas de espín de membrana de gel de sílice, fenol-cloroformo), todavía puede producir fragmentos de ADN de hasta 20 kilobases (kb). Por lo tanto, siempre que haya suficiente rendimiento, esta forma de ADN aislado se puede utilizar para la preparación de la biblioteca de tamaño de plaquita única, en la que el tamaño de la plaquita es a menudo de 500 pares de base (bp), ysegeneran lecturas de secuencia corta de 100 bp. Este ADN es particularmente útil para proyectos de “resecuenciación” o estudios en los que no se requieren datos cromosómicos de longitud completa. El ADN HMW (10-150 kb) es más difícil y sólo se puede obtener de forma fiable utilizando tejido que ha sido rápidamente congelado en LN2 después de la cosecha y mantenido a un máximo de -80 oC hasta la extracción.
El bajo peso molecular o el ADN fragmentado a menudo es suficiente para enfoques específicos, incluida la amplificación de genes a través de PCR y la secuenciación de lectura corta13. Las investigaciones basadas en PCR utilizando ADN LMW que se dirigen sólo a uno o unos pocos genes han sido muy informativas en la comprensión de la adaptación y la evolución molecular de la biología sensorial demurciélagos 6,14, fisiología15, filogenética 5,16, y conservación17,18. También se ha demostrado una recaptura exitosa de secuencias dirigidas de bajo peso molecular y ADN fragmentado para numerosos grupos de vertebrados, incluidos los murciélagos19. Estos métodos son a menudo rentables y mínimamente invasivos para el murciélago, ya que las muestras fecales y el muestreo de tejido no letal a través de hisopos bucales o punzones de biopsia de ala también son formas comunes de obtener ADN para análisis de bajo peso molecular20, 21.
Sin embargo, la calidad depende en gran medida del tipo de soporte en el que se almacena la muestra22. Después de comparaciones sistemáticas y cuantitativas de hisopos bucales y punzantes de biopsia, se ha demostrado que los punzones de biopsia de alas producen consistentemente niveles más altos de ADN y fueron menos estresantes para el murciélago durante la recolección22. Estas comparaciones también mostraron que los mejores resultados se obtuvieron cuando el punzón del ala se conservó en sílice indicadora (es decir, un tipo de desecante hecho de cuentas de gel de sílice que cambia de color cuando se observa humedad) en lugar de en otros medios de almacenamiento populares como etanol o DMSO22; sin embargo, no se examinaron otros medios de almacenamiento, incluida la solución de estabilización de tejidos. Los punzones de las alas también se pueden utilizar para cultivar células fibroblastas en cultivo, como en Kacprzyk et al.23 y como se describe a continuación (ver sección 6). Para estos métodos, el ala o el uropatagium deben extenderse suavemente, y se debe utilizar un punzón de biopsia limpio, típicamente de 3 mm de diámetro, para obtener la muestra. Este enfoque parece no causar daño duradero, con cicatrices curando en cuestión de semanas en la mayoría de los casos24.
El ADN HMW (10-150 kb) es más difícil y actualmente sólo se obtiene de forma fiable utilizando tejido que ha sido rápidamente congelado en LN2 después de la cosecha y mantenido a un máximo de -80 oC hasta la extracción. El ADN HMW (10-150 kb) es crucial para la secuenciación de ADN de lectura prolongada y, por lo tanto, para el ensamblaje del genoma de novo. De hecho, si bien la mayoría de los kits comerciales se pueden utilizar para aislar algunos ADN HMW estándar, los tamaños de molécularesultantes a menudo no cumplen con los requisitos de las tecnologías de secuenciación de tercera generación [por ejemplo, las lanzadas por empresas como Pacific Biosciences (PacBio), Oxford Nanopore Technologies, y 10x Genomics, o a través de métodos de montaje ofrecidos por Bionano Genomics o Dovetail Genomics]. Como tal, existe una nueva demanda de ADN “ultra HMW” (>150 kb). Al obtener ADN ultra HMW de murciélagos, muestras frescas de hígado, cerebro o músculo son todas adecuadas, pero estas deben ser congeladas inmediatamente en LN2 sin ningún búfer de almacenamiento o crioprotector. Una descripción completa de estos pasos está fuera del alcance de este documento, pero están disponibles en otros lugares25.
Tejido para ARN
El ARN es una molécula de una sola cadena que es menos estable que el ADN. Aunque hay muchas formas de ARN, los análisis -omics tienden a centrarse en el ARNm (ARN mensajero) y los ARN pequeños (por ejemplo, microARN). Después de la transcripción, el ARNm se empalma para formar una transcripción madura que no contiene intrones y representa la porción codificante de genes/genomas. Los genes de codificación representan una pequeña fracción del tamaño del genoma (1%-2%), lo que hace que el ARNm objetivo sea un medio rentable para obtener datos de secuencia para los genes. Los MicroRNAs son una clase de ARN que regulan el proceso de traducción del ARNm en proteínas y, por lo tanto, son importantes efectores reguladores. Las transcripciones de ARN se pueden secuenciar individualmente, o más comúnmente para los análisis -omics26,27,28,29,30, como parte de un transcriptoma; es decir, el total de todas las transcripciones de ARN presentes en una muestra dada.
La secuenciación se puede realizar siguiendo varios métodos (es decir, a través de ARN-seq de lectura corta o isoforma entera de lectura larga Seq), permitiendo el análisis tanto de la abundancia de ARN como del uso isoform. A medida que la cantidad y diversidad de transcripciones de ARNm varía entre células y tejidos, la secuenciación del ARN permite estudiar y comparar la expresión génica y la regulación entre muestras. El interés en secuenciar pequeños ARN y secuenciación isoforme entera está creciendo, ya que estos métodos son cada vez más informativos biológicamente. La preparación de muestras de tejido para secuenciar diferentes clases de ARN se puede realizar de la misma manera que se presenta en este manuscrito, con sólo los métodos de extracción posteriores diferentes31,32. Por último, debido a que los transcriptomas ofrecen un subconjunto de alta cobertura del genoma de codificación de proteínas, el conjunto de datos ensamblado puede ser útil en el ensamblaje y anotación del genoma, haciendo que la recopilación de datos de ARN-seq a través de una gama de diferentes tejidos sea un componente importante de la Iniciativa Bat1K.
A diferencia del ADN, el ARN es químicamente inestable y también está dirigido por las enzimas RNase, que están presentes omnipresentes en los tejidos que se colocan como una estrategia defensiva contra los virus basados en ARN. Por estas razones, la fracción de ARN en células y tejidos comienza a degradarse poco después del punto de muestreo y/o eutanasia. Por lo tanto, la preservación del ARN requiere medidas para evitar su degradación. Por lo general, esto implica preservar el tejido recién recolectado a 4 oC en un agente estabilizador, como la solución estabilizadora del ARN, para inactivar las RNases presentes naturalmente en los tejidos, seguido de congelación para un almacenamiento a largo plazo. Como alternativa preferida, el tejido puede ser congelado en LN2; aunque como se señaló anteriormente, transportar LN2 al campo y mantener niveles para evitar que el tejido se deshaga puede ser logísticamente difícil.
Tejido para proteínas
La composición proteica y la abundancia relativa varían entre las células y los tejidos de una manera similar a lo que se discutió para el ARN; sin embargo, las proteínas son en promedio más estables que el ARN. La identificación de proteínas utilizando proteómica típicamente coincide con una fracción de, y no toda, la secuencia de proteínas, pero puede proporcionar información sobre la expresión a través de los tejidos y caracterizar los patógenos presentes. Como muchas secuencias de proteínas se conservan en todos los mamíferos, las muestras de murciélagos para la proteómica pueden contaminarse fácilmente con proteínas humanas conservadas, lo que requiere protocolos estériles (por ejemplo, guantes, fórceps) durante la recolección. Mientras que la congelación del flash en LN2 es la mejor manera de prevenir la degradación de las proteínas, el uso de hielo seco, congeladores de -20 oC, e incluso el hielo son adecuados si no hay otros medios. A medida que aumentan las temperaturas, también aumenta el riesgo de descomposición diferencial de proteínas. Los agentes estabilizadores, como la solución de estabilización de tejidos, son eficaces para preservar la fracción proteica de los tejidos a temperatura ambiente y son adecuados para la conservación a corto plazo (hasta una semana) cuando la congelación del flash no es viable.
El perfil enzimático de un tejido dado influye directamente en la preservación de la proteína en él. Los tejidos con baja actividad enzimática como el músculo pueden preservar los perfiles de proteínas incluso a temperaturas más altas en un congelador doméstico. Por el contrario, el tejido hepático es enzimáticamente reactivo, y sus proteínas tienen mayores probabilidades de degradarse durante la preparación. El creciente número de protocolos para obtener perfiles proteómicos humanos a partir de muestras de parafina incrustada en formalina (FFPE) sugiere que la fijación de tejidos paraformaldehídes promete la preservación de proteínas de bajo costo cuando la congelación al recolectarse no es factible33,34. Aunque dependen en gran medida del tiempo y la condición de conservación, las proteínas se han identificado a través de la inmunohistoquímica de muestras de murciélagos fijas en formalina y conservadas con etanol35. Este enfoque no es escalable para el muestreo de nivel proteómico, pero destaca la posibilidad de que los tejidos de murciélago fijados en formalina produzcan perfiles de proteínas cuando la congelación de flash no está disponible y otros agentes estabilizadores son demasiado costosos.
Tejido para el cultivo celular
El tejido de muestreo y la congelación de flash ofrecen una cantidad finita de material a utilizar, y una vez que se utiliza el material, ya no está disponible. Alternativamente, los cultivos celulares proporcionan células vivas que se pueden utilizar o conservar inmediatamente para futuros estudios. Los cultivos también facilitan la expansión de las células para aumentar el rendimiento cuando las muestras de tejido son pequeñas. Es particularmente útil en casos donde la recolección de tejidos es limitada, como experimentos con especies raras en los que el muestreo no letal es esencial y, por lo tanto, tiene amplias implicaciones para la conservación. Descrito es un protocolo en el que el cultivo celular es posible a través de muestreo no letal de tejido de membrana de las alas, pero el cultivo es posible con múltiples tipos de tejido36,37. El protocolo proporcionado aquí selecciona para las células adherentes. La combinación de tejido fuente y medios de crecimiento utilizados hace que este protocolo sea adecuado para seleccionar y crecer fibroblastos, pero si se desea, se pueden utilizar protocolos alternativos para seleccionar otros tipos de células. En el contexto del proyecto Bat1K, se prevé que para las especies raras y amenazadas, el muestreo no letal de las membranas de las alas y la expansión de las muestras a través del cultivo es esencial para generar el volumen de ADN necesario para las múltiples tecnologías empleadas5 .
Captura de murciélagos
Todas las personas que manipulan murciélagos deben ser entrenadas por un investigador competente para murciélagos y vacunadas contra la rabia con una serie de inyecciones previas a la exposición. Si se muerde, todavía es necesaria otra serie de inyecciones post-exposición. Los métodos estándar para capturar murciélagos incluyen redes de niebla (Figura 1) y trampas de arpa (Figura 2). Las redes de niebla se utilizan con mayor frecuencia e ideales para áreas con actividad baja a moderada, ya que requieren el mayor cuidado para minimizar la angustia de los murciélagos. Los murciélagos pequeños son particularmente vulnerables y pueden morir por estrés si no se atenden a hacerlo rápidamente. Las inspecciones netas frecuentes minimizan las lesiones y mortalidad de los murciélagos, así como los daños en la red de niebla. Este detalle es importante porque la recolección adecuada de tejido requiere que el tejido esté fresco, y la atención inadecuada a las redes de niebla en los murciélagos puede conducir a una mortalidad innecesaria o mortalidad prematura antes de que el investigador pueda procesar correctamente las muestras. Debido a que varios murciélagos pueden descansar en una trampa de arpa con una angustia mínima, este enfoque es ideal para áreas con alta actividad de murciélagos, como cerca de una cueva o gran dormidero. Las instrucciones detalladas para la captura adecuada de murciélagos y el procesamiento de datos para la recopilación de información morfológica y demográfica están disponibles en los métodos suplementarios.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo discutido en este manuscrito describe las mejores prácticas de muestreo para varios análisis moleculares de alto rendimiento de murciélagos. Todos los estudios exitosos -omics requieren tejido de alta calidad, pero el muestreo de tejido murciélago, así como otros organismos no modelo, a menudo ocurre en condiciones de campo que no se pueden establecer en los mismos estándares que los de un entorno de laboratorio controlado. El muestreo a menudo ocurre en lugares remotos, con recursos mínimos, incluido…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Centro de Ecología y Biodiversidad CEBIO, Erika Paliza, Miluska Sánchez, Jorge Carrera, Edgar Rengifo Vásquez, Harold Porocarrero Zarria, Jorge Ruíz Leveau, Jaime Pecheco Castillo, Carlos Tello, Fanny Cornejo y Fanny Fernández Melo por hacer tejido colección en Perú posible. También damos las gracias a todos los miembros de Grupo Jaragua y Yolanda León por hacer posible la recolección de tejidos en la República Dominicana, así como a Bernal Rodríguez Hernández, Bernal Matarrita, y a todos en la Estación de Investigación Biológica La Selva en Costa Rica, por hacer muestreo posible. Agradecemos a Ella Lattenkamp & Lutz Wiegrebe por el acceso y la colección de muestras de golpes de alas de phyllostomus decolorado murciélagos para la generación de cultivo celular. Phyllostomus discolor murciélagos se originaron en una colonia de cría en el Departamento de Biología II de la Universidad Ludwig-Maximilians en Múnich. La aprobación para mantener y criar los murciélagos fue emitida por la oficina veterinaria del distrito de Múnich. LMD, SJR, KTJD y LRY fueron financiados por NSF-DEB 1442142. LMD fue financiado por NSF-DEB 1838273. LRY fue financiado por el NSF-PRFB 1812035. SCV y PD fueron financiados por un Premio Max Planck Research Group, y una beca de Investigación del Programa de Ciencias de Fronteras Humanas (HFSP) (RGP0058/2016). SJR, JHTP y KTJD fueron financiados por el Consejo Europeo de Investigación (ERC Starting grant 310482 [EVOGENO]) otorgado a SJR, ECT fue financiado por la subvención del Consejo Europeo de Investigación (ERC-2012-StG311000).
Materials
| 1.5 mL Eppendorf Safelock tubes | Fischer Scientific | 10509691 | 1.5 mL sterile tubes used during cell culture protocol |
| 15 mL tubes | Sarstedt | 62,554,002 | 15 mL sterile tubes used during cell culture protocol |
| 2 mL cryovials | Thomas Scientific | 1154P75 | cryogenic vials for tissues to be stored in liquid nitrogen |
| 3-mm biopsy punch | Medline | MIL3332 | wing biopsy punch for cell culture |
| 6 well plate | Greiner | 83,392 | Culture vessle |
| Allprotect Tissue Reagent | Qiagen | 76405 | for fecal samples; tissue stabilizing solution |
| Cell counting slides for TC10/TC20 cell counter, dual chamber | Bio-Rad | 145-0011 | Chambers for the count cells using the automated cell counter TC20 by Bio-Rad |
| collagenase IV | Stemcell Technologies | 7909 | For dissociation of primary cells |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650-5X5ML | Prevents crystalization of water during freezing of the cells. |
| DMEM–Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher | 12491-015 | culture media |
| Dulbecco's PBS | Invitrogen | 14190169 | Balanced salt solution used for washing cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Fischer Scientific | 10270106 | Serum-supplement for in vitro cell culture of eukaryotic cells |
| Gentamycin sulfate salt | Sigma Aldrich | G1264-250MG | Antibiotic for culture media |
| Nalgene Mr. Frosty | Thermo Scientific | 5100-0050 | Freezing container which provides 1°C/min cooling rate |
| PARAFILM | Sigma | P7793 | Wrapping tubes etc for sealing |
| Penicillin-streptomycin (pen-strep), 100x | Invitrogen | 15140130 | Antibiotic for culture media |
| Phosphate-buffered saline (PBS) 10x, pH 7.4 | Thermo Fisher | 10010023 | salt buffer used for washes and storage of bone tissue; dilute to 10X using de-ionized water |
| RNAlater | Thermo Fisher | AM7021 | RNA stabilizing solution |
| RNAse away | Genetech | 83931-250mL | breaks down enzymes that lead to RNA degradation |
| Silica gel | Fisher Scientific | 7631-86-9 | dessicant agent |
| TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | 1450102 | Automated cell counter |
| Trypan blue | Bio-Rad | 145-0013 | Cell stain used to assess cell viability |
| trypsin-EDTA | Sigma Aldrich | T4049 | For dissociation of cells during splitting |
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