Vävnads insamling av fladdermöss för-omics-analyser och primär cell kultur

Summary

Detta är ett protokoll för optimal vävnads beredning för genomisk, transkriptomisk och proteomisk analys av fladdermöss som fångats i naturen. Den innehåller protokoll för BAT fånga och dissektion, vävnad bevarande, och cellodling av BAT vävnad.

Abstract

I och med att sekvenstekniker med hög kapacitet avancerar kan standardiserade metoder för vävnads anskaffning och bevarande av hög kvalitet möjliggöra en utvidgning av dessa metoder till icke-modellorganismer. En serie protokoll för att optimera vävnads insamling från fladdermöss har utvecklats för en rad sekvenserings metoder med höga dataflöden. Beskrivs här är protokoll för fångst av fladdermöss, önskad demografi som ska samlas in för varje bat, och optimerade metoder för att minimera stress på en fladdermus vid vävnads insamling. Specifikt beskrivs metoder för att samla in och behandla vävnad för att erhålla (i) DNA för högmolekylära genomiska analyser, (II) RNA för vävnadsspecifika transkriptomer, och (III) proteiner för proteomisk nivå analyser. Slutligen, också beskrivs är en metod för att undvika dödliga provtagning genom att skapa livskraftiga primära cellkulturer från Wing klipp. En central motivation av dessa metoder är att maximera mängden potentiella molekylära och morfologiska data för varje bat och föreslå optimala sätt att bevara vävnader så att de behåller sitt värde som nya metoder utvecklas i framtiden. Denna standardisering har blivit särskilt viktig eftersom initiativ för att sekvensera kromosomnivå, felfria genomar av arter över hela världen har uppstått, där flera vetenskapliga partier går i spetsen för sekvenseringen av olika taxonomiska Grupper. De protokoll som beskrivs häri definierar den idealiska vävnad insamling och vävnads Bevarandemetoder för Bat1K, konsortiet som sekvenserar genomen av varje art av fladdermus.

Introduction

Hög dataflöde sekvensering (HTS) metoder har snabbt avancerade i effektivitet och minskade i kostnad, och det är nu möjligt att skala dessa metoder till hundratals eller tusentals exempel. Insikter erhållna genom tillämpning av dessa tekniker har enorma effekter över flera vetenskapliga discipliner, från biomedicin till evolution och ekologi^1,2,3. Men många HTS applikationer förlitar sig kritiskt på hög kvalitet nukleinsyror från en levande källa. Denna begränsning kommer sannolikt att bli alltmer problematiskt med utvecklingen av tredje generationens sekvensering baserad på långlästa molekyler⁴. Av dessa skäl finns det ett behov av att inrikta insatserna på att fastställa bästa praxis för insamling av färska vävnadsprover från vilda organismer utanför laboratoriet, vilket maximerar nyttan av materialet och minskar antalet individer som behöver Samlas in.

Bat1K är ett internationellt konsortium av forskare med ett pågående initiativ för att sekvensera genomet av varje art av fladdermus till kromosomnivå församling⁵. Fladdermöss representerar 20% av däggdjurs mångfalden och har exceptionella anpassningar som har betydelse för förståelsen av åldrande, sjukdoms ekologi, sensorisk biologi och metabolism^5,6. Många fladdermöss är också hotade eller hotade på grund av mänsklig exploatering⁷ eller snabbt minskar på grund av patogener^8,9, och genom-nivå sekvensering är av stor betydelse för bevarandet av dessa arter. Även om Bat1K för närvarande syftar till att sekvensera arvsmassan hos alla fladdermöss, är standardiseringen av insamling av vävnadsprover för högkvalitativ genomisk sekvensering fortfarande en central utmaning i hela gemenskapen av organismers biologer. Förutom genomiska data kräver funktionell förståelse av mångfalden av BAT-anpassningar vävnadsspecifika transkriptome-och protein analyser, som ofta kräver separata insamlings protokoll. Dessutom, liksom för alla taxonomiska grupper, samtidigt som optimal vävnads insamling och bevarande är avgörande för att erhålla data av högsta kvalitet för-omics-analyser, är det ofta svårt att kommunicera bästa praxis på grund av snabbt föränderliga teknologier och flera forskargrupper som arbetar självständigt.

Behovet av att anta bästa praxis för forskning om BAT-omics är särskilt brådskande med tanke på att många fladdermusarter är sällsynta eller hotade. Till skillnad från andra små däggdjur som gnagare och nävar, fladdermöss är långlivade, som hänför sig till exceptionella mekanismer DNA-reparation¹⁰ och långsam reproduktion¹¹, med de flesta arter som föder bara en eller (i några fall) två unga per år. Av dessa skäl, fladdermöss populationer kan vara långsam att återhämta sig från störningar, och samla in många individer från naturen är varken tillrådligt eller genomförbart. Med andra ord måste protokollen optimeras för att erhålla den maximala mängden data för ett enda prov, vilket minskar behovet av att i onödan replikera provtagnings insatserna.

Här fokuserar detta protokoll specifikt på standardiserade metoder för insamling och provtagning av BAT-vävnad för genomisk och transkriptomisk sekvensering och protein analyser. Dess högsta prioritet är att se till att bat-vävnaderna samlas in på ett etiskt och ansvarsfullt sätt, alltifrån tillståndsprocessen för insamling, export av vävnader till minimering av stress till djuret och långtidslagring. Utarbetade dissektioner har utvecklats i syfte att framtidssäkra nyttan av olika material som samlats in. Detta manuskript ger en steg-för-steg-guide för att samla fladdermöss på ett humant sätt som är avsett att minimera påverkan på populationer och maximera vetenskapligt värde. Medan fokus för detta protokoll är specifikt för användning i fladdermöss, är många av stegen relevanta för andra arter av ryggradsdjur, särskilt däggdjur.

Översikt över vävnads insamling
Förfarandet för insamling av vävnader, inklusive temperaturen för lagring och valet av konserveringsmedel, kommer att bestämmas av arten av de planerade analyser som planeras i efterföljande led. Det rekommenderas dock starkt att, när det är möjligt, vävnad samlas in under en rad metoder för att maximera dess framtida nytta även om ingen specifik analys planeras. I allmänhet, vävnad samlas in och bevaras för efterföljande analyser av antingen nukleinsyror (DNA och RNA), eller protein. För vart och ett av dessa tillämpningar kan vävnaden bevaras optimalt genom direkt blixt nedfrysning i flytande kväve (LN2). Dock är omedelbar nedsänkning i LN2 inte alltid möjligt på fältet. Som teknik framsteg, resurser såsom specialiserade flaskor för att lagra DNA och RNA vid omgivningstemperaturer blir mer lättillgängliga. Även om vi inte har validerat alla sådana material i detta protokoll, uppmuntrar vi andra forskare att jämförelsevis analysera resultatet av nya material i förhållande till vad vi presenterar här. Vi tillhandahåller metoder för att helst bevara vävnad för olika tillämpningar i situationer där LN2 inte kan nås, till exempel när LN2 transport inte är möjlig på grund av platsåtkomst via litet flygplan i Amazonas. Dessutom tillhandahåller vi en metod för att samla in vävnad från vilka levande celler kan odlas och spridas. Nedan beskriver vi viktiga överväganden för insamling av material för vart och ett av dessa respektive ändamål och en översikt över insamlingsmetoder ges i tabell 1.

Vävnad för DNA
För all skördad vävnad som samlats in, kommer lagringsmediet avgöra om det kan användas för antingen standard eller hög molekylvikt (HMW) DNA-extraktion. HMW krävs för lång läsning sekvensering och för närvarande krävs för att generera kromosomnivå arvsmassa sammansättningar, eller en “Platinum standard” genomet. Låg molekylvikt (LMW) DNA kan extraheras från Flash fryst, AllProtect (hädanefter kallad “Tissue stabiliserande lösning”), eller till och med RNAlater (hädanefter “RNA stabiliserande lösning”)-konserverade prover (även om Flash frysta prover förblir optimala ). DNA som isolerats av standardiserade laboratoriemetoder (t. ex. kiselgel membran spinn pelare, fenol-kloroform) kan fortfarande ge DNA-fragment på upp till ~ 20 kilobaser (KB). Därför, förutsatt att det finns tillräcklig avkastning, denna form av isolerade DNA kan användas för enstaka skär storlek bibliotek förberedelse, där insatsen storlek är ofta ~ 500 Base-par (BP), och kort sekvens läsningar av ~ 100 BP genereras¹². Detta DNA är särskilt användbart för “resekvensering” projekt eller studier där fullängds kromosomala data inte krävs. HMW DNA (10-150 kB) är mer utmanande och kan endast fås på ett tillförlitligt sätt med hjälp av vävnad som snabbt har Blixts fryst i LN2 efter skörd och underhålls vid ett maximum av-80 ° c till extraktion.

Låg molekylvikt eller fragmenterat DNA är ofta tillräckligt för riktade metoder, inklusive genamplifiering via PCR och kortläst sekvensering¹³. PCR-baserade undersökningar som använder LMW-DNA som endast riktar sig till en eller några få gener har varit mycket informativa i förståelsen av anpassning och den molekylära utvecklingen av fladdermussensorisk biologi^6,14, fysiologi¹⁵, fylogenetik ^5,16, och bevarande^17,18. Framgångsrik riktad sekvens återbildning av låg molekylvikt och fragmenterad DNA har också visats för många ryggradsdjur grupper, inklusive fladdermöss¹⁹. Dessa metoder är ofta kostnadseffektiva och minimalt invasiva till bat, som fekal prover och icke-dödande vävnad provtagning via buckala svabbbarna eller vingar biopsi stansar är också vanliga sätt att få DNA för låg molekylvikt analyser^{20, 21}.

Kvaliteten beror dock i hög grad på vilken typ av media som provet är lagrat i²². Efter systematiska och kvantitativa jämförelser av buckala kompresser och biopsi stansar, vinge biopsi stämplingar har visat sig ge genomgående högre nivåer av DNA och var mindre stressande att bat under samling²². Dessa jämförelser visade också att de bästa resultaten erhölls när vingslag var bevarad i indikator kiseldioxid (dvs, en typ av torkmedel av kiselgel pärlor som ändrar färg när fukt observeras) snarare än i andra populära lagringsmedia såsom etanol eller DMSO²²; även andra lagringsmedia inklusive vävnads stabilisering lösning inte undersökts. Wing stansar kan också användas för att odla fibroblastceller i kulturen, såsom i Kacprzyk et al.²³ och som beskrivs nedan (se avsnitt 6). För dessa metoder bör vinge eller uropatagium utökas försiktigt, och en ren biopsi Punch, typiskt 3 mm i diameter, bör användas för att få provet. Detta tillvägagångssätt verkar orsaka någon bestående skada, med ärr läkning över inom veckor i de flesta fall²⁴.

HMW DNA (10-150 kB) är mer utmanande och är för närvarande endast tillförlitligt erhålls med hjälp av vävnad som har snabbt blinkar fryst i LN2 efter skörd och upprätthålls vid ett maximum av-80 ° c till extraktion. HMW DNA (10-150 kB) är avgörande för lång-läsa DNA-sekvensering och därför för de Novo genommontering. I själva verket, medan de flesta kommersiella Kit kan användas för att isolera vissa standard HMW DNA, de resulterande molekyl storlekar ofta inte uppfyller kraven i tredje generationens sekvenserings teknik [t. ex. de som lanserades av företag som Pacific Biosciences (PacBio), Oxford Nanopore Technologies, och 10X genomik, eller genom monteringsmetoder som erbjuds av Bionano Genomics eller dovetail Genomics]. Som sådan, det finns en ny efterfrågan på “Ultra HMW” DNA (> 150 kB). När du skaffar Ultra HMW DNA från fladdermöss, färska prover av lever, hjärna, eller muskler är alla lämpliga, men dessa måste omedelbart blinka fryst i LN2 utan någon lagringbuffert eller cryoprotectant. En fullständig beskrivning av dessa steg ligger utanför tillämpningsområdet för detta dokument, men finns på andra ställen²⁵.

Vävnad för RNA
RNA är en enkelsträngad molekyl som är mindre stabil än DNA. Även om det finns många former av RNA,-omics analyser tenderar att fokusera på mRNA (Messenger RNA) och små RNAs (t. ex. microRNAs). Efter transkription, är mRNA skarvas för att bilda en mogen avskrift som inte innehåller några introner och representerar kodnings delen av gener/genomer. Kodninggener står för en bråkdel av genomets storlek (1%-2%), vilket gör målgruppen mRNA till ett kostnadseffektivt sätt att erhålla sekvensdata för gener. MicroRNAs är en klass av RNAs som reglerar processen för översättning av mRNA till proteiner och är därmed viktiga regulatoriska effektorer. RNA-utskrifter kan sekvenseras individuellt, eller mer allmänt för-omics analyser^{26,27,28,29,30}, som en del av en transkriptome; det vill, summan av alla RNA-transkriptioner som finns i ett givet prov.

Sekvensering kan utföras efter flera metoder (dvs. via kortlästa RNA-SEQ eller långlästa hela isoform SEQ), vilket möjliggör analys av både RNA-överflöd och isoform-användning. Eftersom mängden och mångfalden av mRNA-transkriptioner varierar mellan celler och vävnader gör RNA-sekvenseringen det möjligt att studera och jämföra genuttryck och reglering över prover. Intresset för att sekvensera små RNAs och hela isoform sekvensering växer, eftersom dessa metoder blir allt mer biologiskt informativ. Beredning av vävnadsprover för att sekvensera olika klasser av RNA kan utföras på samma sätt som presenteras i detta manuskript, med endast de efterföljande extraktionsmetoderna skiljer^31,32. Slutligen, eftersom transkriptom erbjuder en hög täckning delmängd av protein-kodning arvsmassan, den sammansatta datauppsättningen kan vara användbar i genommontering och anteckning, vilket gör insamling av RNA-SEQ data över en rad olika vävnader en viktig del av Bat1K initiativ.

I motsats till DNA, RNA är kemiskt instabil och även riktad av RNase enzymer, som är ubiquitously närvarande i vävnad celllysat som en defensiv strategi mot RNA-baserade virus. Av dessa skäl börjar RNA-fraktionen i celler och vävnader att brytas ned kort efter provtagnings-och/eller dödshjälp. Att bevara RNA kräver därför åtgärder för att förhindra dess nedbrytning. Detta innebär vanligtvis att bevara nyinsamlad vävnad vid 4 ° c i ett stabiliserande medel såsom RNA stabiliserande lösning för att inaktivera de RNases naturligt i vävnader, följt av frysning för längre sikt lagring. Som ett föredras alternativ, kan vävnad vara Flash fryst i LN2; även som nämnts ovan, transporterar LN2 in i fältet och bibehålla nivåer för att förhindra att vävnaden upptinning kan vara logistiskt utmanande.

Vävnad för protein
Protein sammansättning och relativ överflöd varierar mellan celler och vävnader på ett liknande sätt som diskuterades för RNA; proteiner är dock i genomsnitt stabilare än RNA. Protein identifiering med proteomik matchar vanligtvis en bråkdel av, och inte hela, proteinsekvensen, men den kan tillhandahålla information om uttryck över vävnader och karakterisera patogener närvarande. Eftersom många proteinsekvenser bevaras över däggdjur, kan bat prover för proteomik lätt kontamineras med bevarade mänskliga proteiner, kräver sterila protokoll (t. ex. handskar, pincett) under insamling. Medan Flash-frysning i LN2 är det bästa sättet att förhindra nedbrytning av proteiner, användning av torris,-20 ° c frysar, och även is är lämpliga om det inte finns några andra medel. När temperaturerna ökar stiger också risken för differential proteinnedbrytning. Stabiliserande medel såsom vävnads stabilisering lösning är effektiva för att bevara proteinfraktion av vävnader vid rumstemperatur och är lämpliga för korttids bevarande (upp till en vecka) när blixten fryser inte är lönsamt.

Den enzymatiska profilen för en given vävnad påverkar direkt bevarandet av proteinet däri. Vävnader med låg enzymatisk aktivitet såsom muskler kan bevara protein profiler även vid högre temperaturer i ett hushåll frys. Däremot är levervävnad enzymatiskt reaktiv, och dess proteiner har högre sannolikheter för förnedrande under beredning. Det ökande antalet protokoll för att erhålla mänskliga proteomiska profiler från formalin-fast paraffin-inbäddade (FFPE) prover tyder på att PARAFORMALDEHYD fastställande av vävnader har löfte om låg kostnad protein bevarande när frysning vid insamling är inte genomförbar^33,34. Även om det är mycket beroende av bevarandetid och tillstånd, proteiner har identifierats via immunohistokemi från formalin-fasta, etanol-konserverade bat exemplar³⁵. Denna metod är inte skalbar till proteomic-nivåprovtagning men belyser potentialen för formalin-fasta bat-vävnader att ge protein profiler när blixt nedfrysningen inte är tillgänglig och andra stabiliserande medel är för kostsamma.

Vävnad för cellodling
Provtagning vävnad och blixt-frysning erbjuder en ändlig mängd material som skall användas, och när materialet används, är det inte längre tillgänglig. Alternativt, cellkulturer ger levande celler som omedelbart kan användas eller bevaras för framtida studier. Kulturer underlättar också expansion av celler för att öka avkastningen när vävnadsprover är små. Det är särskilt användbart i fall där vävnads insamling är begränsad, såsom experiment med sällsynta arter där icke-dödande provtagning är viktigt och därför har stora konsekvenser för bevarandet. Beskrivs är ett protokoll där cellkultur är möjligt via icke-dödande provtagning av Ving membran vävnad, men odling är möjlig med flera vävnadstyper^36,37. Det protokoll som anges här väljer för adherenta celler. Kombinationen av källa vävnad och tillväxt medier som används gör detta protokoll lämpar sig för att välja och odla fibroblaster, men om så önskas, kan alternativa protokoll användas för att välja för andra celltyper. I samband med projektet Bat1K förutspås det att för sällsynta och hotade arter, är icke-dödande provtagning av Ving membran och expansion av prover genom odling viktigt att generera den volym av DNA som behövs för de många tekniker som används⁵ .

Bat Capture
Alla som hanterar fladdermöss bör utbildas av en bat-kompetent forskare och vaccineras mot rabies med en serie före exponerings injektioner. Om biten, en ytterligare serie av efter exponering injektioner är fortfarande nödvändigt. Standard metoder för att fånga fladdermöss är bland annat dim nät (figur 1) och Harpan (figur 2). Mist Nets används oftast och är idealiska för områden med låg till måttlig aktivitet, eftersom de kräver mest omsorg för att minimera bat nöd. Små fladdermöss är särskilt sårbara och kan dö av stress om de inte tenderade att snabbt. Täta netto inspektioner minimerar bat-skador och dödlighet samt skador på dimnätet. Denna detalj är viktig eftersom en ordentlig vävnads uppsamling kräver att vävnaden är fräsch, och olämplig uppmärksamhet på dimnäten i fladdermöss kan leda till onödig dödlighet eller förtida dödlighet innan forskaren kan bearbeta prover på rätt sätt. Eftersom flera fladdermöss kan vila i en harpa fälla med minimal nöd, är denna metod idealisk för områden med hög fladdermus aktivitet, såsom nära en grotta eller stor hönshus. Detaljerade instruktioner för korrekt hantering av fladdermöss och databehandling för insamling av morfologisk och demografisk information finns i kompletterande metoder.

Protocol

Alla metoder som beskrivs här har godkänts av den institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC) av Stony Brook University (protokoll #2013-2034). 1. dödshjälp Fukta en bomullstuss med en isofluran bedövningsmedel eller annan tillgänglig bedövningsmedel. Placera bomullstuss i en återförslutningsbar, lufttät plastpåse. Påsen bör vara tillräckligt stor för att hålla en påse i en trasa bat väska bekvämt. Efter flera minuter att låta…

Representative Results

DnaFör standardanalyser av låg molekylvikt (LMW) utvunnits DNA från tre arter av neotropiska fladdermöss. Vävnadsprover samlades in på fältet från Dominikanska republiken och Costa Rica, enligt de protokoll som beskrivs i detta dokument. Efter dissektion, små bitar (< 0,5 cm vid den tunnaste delen) av blandade vävnader (hjärna, lever, och tarm) placerades i RNA-stabiliserande lösning, blixt fryst, sedan lagras vid-80 ° c. Extraktioner utfördes med standa…

Discussion

Det protokoll som diskuteras i detta manuskript beskriver de bästa provtagningsmetoderna för olika molekylära analyser av fladdermöss med hög kapacitet. Alla lyckade omics-studier kräver vävnad av hög kvalitet, men provtagning av fladdermusvävnad, liksom andra icke-modellorganismer, förekommer ofta i fältförhållanden som inte kan ställas in på samma standarder som för kontrollerade laboratoriemiljöer. Provtagning sker ofta på avlägsna platser, med minimala resurser, inklusive begränsad tillgång till …

Materials

1.5 mL Eppendorf Safelock tubes	Fischer Scientific	10509691	1.5 mL sterile tubes used during cell culture protocol
15 mL tubes	Sarstedt	62,554,002	15 mL sterile tubes used during cell culture protocol
2 mL cryovials	Thomas Scientific	1154P75	cryogenic vials for tissues to be stored in liquid nitrogen
3-mm biopsy punch	Medline	MIL3332	wing biopsy punch for cell culture
6 well plate	Greiner	83,392	Culture vessle
Allprotect Tissue Reagent	Qiagen	76405	for fecal samples; tissue stabilizing solution
Cell counting slides for TC10/TC20 cell counter, dual chamber	Bio-Rad	145-0011	Chambers for the count cells using the automated cell counter TC20 by Bio-Rad
collagenase IV	Stemcell Technologies	7909	For dissociation of primary cells
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	D2650-5X5ML	Prevents crystalization of water during freezing of the cells.
DMEM–Dulbecco's Modified Eagle Medium	Thermo Fisher	12491-015	culture media
Dulbecco's PBS	Invitrogen	14190169	Balanced salt solution used for washing cells
Fetal bovine serum (FBS)	Fischer Scientific	10270106	Serum-supplement for in vitro cell culture of eukaryotic cells
Gentamycin sulfate salt	Sigma Aldrich	G1264-250MG	Antibiotic for culture media
Nalgene Mr. Frosty	Thermo Scientific	5100-0050	Freezing container which provides 1°C/min cooling rate
PARAFILM	Sigma	P7793	Wrapping tubes etc for sealing
Penicillin-streptomycin (pen-strep), 100x	Invitrogen	15140130	Antibiotic for culture media
Phosphate-buffered saline (PBS) 10x, pH 7.4	Thermo Fisher	10010023	salt buffer used for washes and storage of bone tissue; dilute to 10X using de-ionized water
RNAlater	Thermo Fisher	AM7021	RNA stabilizing solution
RNAse away	Genetech	83931-250mL	breaks down enzymes that lead to RNA degradation
Silica gel	Fisher Scientific	7631-86-9	dessicant agent
TC20 Automated Cell Counter	Bio-Rad	1450102	Automated cell counter
Trypan blue	Bio-Rad	145-0013	Cell stain used to assess cell viability
trypsin-EDTA	Sigma Aldrich	T4049	For dissociation of cells during splitting