-Omics Analizleri ve Birincil Hücre Kültürü için Yarasaların Doku Toplama
Summary
Bu, vahşi doğada yakalanan yarasaların genomik, transkripsiyonik ve proteomik analizleri için en uygun doku hazırlığı için bir protokoldür. Bu yarasa yakalama ve diseksiyon, doku koruma ve yarasa dokusunun hücre culturing için protokoller içerir.
Abstract
Yüksek iş hacmi ne kadar çok yönlü sektirme teknolojileri ilerledikçe, yüksek kaliteli doku edinimi ve korunması için standartlaştırılmış yöntemler, bu yöntemlerin model olmayan organizmalara uzatılmasına olanak sağlar. Yarasalardan doku toplanmasını optimize etmek için bir dizi protokol, bir dizi yüksek iş elde li sıralama yaklaşımı için geliştirilmiştir. Burada özetlenen yarasaların yakalanması için protokoller, her yarasa için toplanacak istenen demografik ve doku toplama sırasında bir yarasa üzerinde stresi en aza indirmek için optimize yöntemleri vardır. Yüksek molekül ağırlıklı genomik analizler için (i) DNA, (ii) dokuya özgü transkripsiyonlar için RNA ve proteomik düzey analizleri için (iii) proteinler elde etmek için doku toplama ve tedavi yöntemleri özellikle özetlenmiştir. Son olarak, aynı zamanda kanat klipleri canlı birincil hücre kültürleri oluşturarak ölümcül örnekleme önlemek için bir yöntemdir. Bu yöntemlerin temel motivasyonu, her yarasa için potansiyel moleküler ve morfolojik veri miktarını en üst düzeye çıkarmak ve gelecekte yeni yöntemler geliştikçe değerlerini koruyabilmeleri için dokuları korumak için en uygun yolları önermektir. Bu standardizasyon, dünya çapında türlerin kromozom düzeyinde, hatasız genomlarını sıralama girişimleri ortaya çıktıkça özellikle önemli hale gelmiştir ve birçok bilimsel taraf farklı taksonomik dizilimi ne lerdir? Grup. Burada özetlenen protokoller Bat1K için ideal doku toplama ve doku koruma yöntemlerini tanımlar, yarasa her türün genomlarını sıralamak olan konsorsiyum.
Introduction
Yüksek verimli sıralama (HTS) yöntemleri hızla verimlilik gelişmiş ve maliyet azalmıştır, ve şimdi yüzlerce veya binlerce örnek bu yaklaşımları ölçeklendirmek mümkündür. Bu teknolojilerin uygulanması ile elde edilen anlayışlar, biyotıp evrim veekoloji1,2,3,birden fazla bilimsel disiplinler arasında büyük etkileri vardır. Ancak, birçok HTS uygulamaları kritik bir canlı kaynaktan yüksek kaliteli nükleik asitler güveniyor. Bu sınırlama, uzun okunanmoleküller4dayalı üçüncü nesil sıralama gelişimi ile giderek daha sorunlu hale gelmesi muhtemeldir. Bu nedenlerden dolayı, laboratuvar dışında yabani organizmalardan taze doku örnekleri nin toplanması için en iyi uygulamaların oluşturulmasına odaklanmak gerekir, bu da malzemenin yararını en üst düzeye çıkarır ve ihtiyaç duyulması gereken bireylerin sayısını azaltır. Toplanan.
Bat1K kromozom düzeyinde montaj5yarasa her türün genom dizilimi için devam eden bir girişim ile bilim adamları uluslararası bir konsorsiyum . Yarasalar memeli çeşitliliğinin% 20 temsil ve yaşlanma, hastalık ekolojisi, duyusal biyoloji ve metabolizma5,6anlamak için etkileri var olağanüstü adaptasyonları var. Birçok yarasa da tehdit veya insan sömürüsü nedeniyle tehlike altında7 veya hızla patojenler nedeniyle azalan8,9, ve genom düzeyinde sıralama bu türlerin korunması için büyük önem taşımaktadır. Bat1K şu anda tüm yarasa türlerinin genomlarını dizilemeyi amaçlasa da, yüksek kaliteli genomik sıralama için doku örneklerinin toplanmasının standartlaştırılması organizma biyologları topluluğu nda önemli bir sorun olmaya devam etmektedir. Genomik verilere ek olarak, yarasa adaptasyonlarının çeşitliliğinin işlevsel olarak anlaşılması dokuya özgü transkripsiyon ve protein analizleri gerektirir ve genellikle ayrı toplama protokolleri gerektirir. Ayrıca, tüm taksonomik gruplarda olduğu gibi, -omik analizler için en yüksek kalitede veri elde etmek için optimum doku toplama ve koruma şartiken, hızla değişen teknolojiler ve bağımsız olarak çalışan birden fazla araştırma ekibi.
Yarasa-omics araştırma için en iyi uygulamaları benimsemeihtiyacı, birçok yarasa türünün nadir veya tehdit altında olduğu göz önüne alındığında, özellikle acildir. Kemirgenler ve sivri fareler gibi diğer küçük memelilerin aksine, yarasalar uzun ömürlüdür, olağanüstü DNA onarım mekanizmaları10 ve yavaş üreme11atfedilebilir , çoğu tür sadece bir veya (birkaç durumda) yılda iki genç doğurma ile. Bu nedenlerden dolayı, yarasa popülasyonları rahatsızlıktan kurtarmak için yavaş olabilir, ve vahşi birçok kişi toplama ne tavsiye edilebilir ne de uygulanabilir. Başka bir deyişle, protokoller tek bir örnek için maksimum veri miktarını elde etmek için optimize edilmeli ve böylece örnekleme çabalarını gereksiz yere çoğaltma gereksinimini azaltmalıdır.
Burada, bu protokol özellikle genomik ve transkripsiyon dizilimi ve protein analizleri için yarasa dokusunun toplanması ve örnekleştirilmesi için standartlaştırılmış yöntemlere odaklanmaktadır. En önemli önceliği, yarasa dokularının toplanması, dokuların ihracatı, stresin hayvana en aza itilmesi ve uzun süreli depolama koşullarına kadar etik ve sorumlu bir şekilde toplanmasını sağlamaktır. Toplanan farklı malzemelerin kullanışlılığını gelecekte de ön plana etmek amacıyla ayrıntılı diseksiyonlar geliştirilmiştir. Bu el yazması, yarasaları popülasyonlar üzerindeki etkiyi en aza indirmek ve bilimsel değeri en üst düzeye çıkarmak amacıyla insancıl bir şekilde toplamak için adım adım bir kılavuz sağlar. Bu protokolün odak yarasalar kullanılmak üzere özel iken, adımların çoğu diğer omurgalı takson, özellikle memeliler ile ilgilidir.
Doku koleksiyonuna genel bakış
Depolama sıcaklığı ve koruyucu madde seçimi de dahil olmak üzere doku toplama prosedürü, planlanan herhangi bir downstream analizlerin niteliğine göre belirlenecektir. Ancak, mümkün olduğunda, belirli bir analiz planlanmamış olsa bile, doku gelecekteki yarar maksimize etmek için yöntemler bir dizi altında toplanır şiddetle tavsiye edilir. Genel olarak, doku toplanır ve nükleik asitler (DNA ve RNA) veya protein sonraki analizleri için korunur. Bu uygulamaların her biri için, doku en iyi sıvı azot (LN2) doğrudan flaş donma ile korunabilir. Ancak, LN2 hemen daldırma her zaman alanında mümkün değildir. Teknoloji ilerledikçe, DNA ve RNA’yı ortam sıcaklıklarında depolamak için özel şişeler gibi kaynaklar daha kolay kullanılabilir hale gelmektedir. Bu protokoldeki tüm bu materyalleri doğrulamamış olsak da, diğer araştırmacıları burada sunduklarına göre yeni malzemelerin performansını karşılaştırmalı olarak analiz etmeye teşvik ediyoruz. LN2’ye erişilemediği durumlarda, örneğin Amazon’daki küçük uçak üzerinden siteye erişim nedeniyle LN2 taşımacılığının mümkün olmadığı durumlarda, farklı uygulamalar için ideal olarak dokuları korumak için yöntemler salıyoruz. Buna ek olarak, canlı hücrelerin yetiştirilip yayıldığı dokuları toplamak için bir yöntem salıyoruz. Aşağıda, bu ilgili amaçlariçin malzeme toplamak için önemli hususlar ı özetliyoruz ve toplama yöntemlerine genel bir bakış Tablo 1’deverilmiştir.
DNA için doku
Toplanan tüm toplanan dokular için, depolama ortamı standart veya yüksek molekül ağırlıklı (HMW) DNA çıkarma için kullanılabilir olup olmadığını belirleyecektir. HMW uzun okuma sıralama için gereklidir ve şu anda kromozom düzeyinde genom derlemeleri oluşturmak için gerekli, ya da bir “platin standart” genom. Düşük molekül ağırlığı (LMW) DNA flaş dondurulmuş elde edilebilir, AllProtect (bundan böyle “doku dengeleme çözümü” olarak anılacaktır), hatta RNAlater (bundan böyle “RNA stabilizasyon çözümü”)-korunmuş numuneler (flaş dondurulmuş numuneler optimal kalsa da ). Standart laboratuvar yöntemleriyle izole edilen DNA (örn. silika jel membran spin kolonları, fenol-kloroform), yine de ~20 kilobaza (kb) kadar DNA parçaları verebilir. Bu nedenle, yeterli verim olması koşuluyla, bu izole DNA formu tek bir kesici uç boyutu kitaplığı hazırlığı için kullanılabilir, hangi insert boyutu genellikle ~ 500 baz çiftleri (bp) ve ~ 100 bp kısa sıra okuma12oluşturulur . Bu DNA özellikle tam uzunlukta kromozomel verilerin gerekli olmadığı “sıralama” projeleri veya çalışmaları için yararlıdır. HMW DNA (10-150 kb) daha zorludur ve sadece hasat tan sonra LN2’de hızla yanıp sönen ve ekstraksiyona kadar en fazla -80 °C’de tutulan doku kullanılarak güvenilir bir şekilde elde edilebilir.
Düşük molekül ağırlığı veya parçalanmış DNA genellikle PCR ve kısa okunur sıralama13ile gen amplifikasyonu da dahil olmak üzere hedefli yaklaşımlar için yeterlidir. SADECE bir veya birkaç genhedef LMW DNA kullanarak PCR tabanlı araştırmalar adaptasyon ve yarasa duyusal biyoloji6molekülerevrimi anlamak son derece bilgilendirici olmuştur ,14, fizyoloji15, filogenetik 5,16, ve koruma17,18. Düşük molekül ağırlığı ve parçalanmış DNA’nın başarılı hedefli sekans ları yeniden ele geçirilirken, yarasalar19dahil olmak üzere çok sayıda omurgalı grubu da gösterilmiştir. Bu yöntemler genellikle düşük molekül ağırlığı analizleri için DNA elde etmek için yaygın yollar olduğu gibi, dışkı örnekleri ve bukkal swabs veya kanat biyopsisi yumruklar yoluyla öldürücü olmayan doku örnekleme, yarasa için maliyet-etkin ve minimal invaziv20, 21. yıl.
Ancak, kalite büyük ölçüde örneğin22depolandığı ortam türüne bağlıdır. Bukkal swabs ve biyopsi yumruklarının sistematik ve kantitatif karşılaştırmalar sonra, kanat biyopsi salgı yumruklar DNA sürekli daha yüksek seviyelerde verim gösterilmiştir ve toplama sırasında yarasa için daha az stresli22. Bu karşılaştırmalar aynı zamanda kanat yumruğu nun gösterge silikasında korunduğunda en iyi sonuçların elde edildiğini de gösterdi (örneğin, nem gözlendiğinde renk değiştiren silika jel boncuklardan yapılmış bir desiccant türü) etanol veya DMSO22; ancak doku stabilizasyon solüsyonu dahil diğer depolama ortamları incelenmemekle birlikte. Kanat yumrukları da kültür fibroblast hücreleri büyümek için kullanılabilir, Kacprzyk ve ark23 gibi ve aşağıda açıklandığı gibi (bölüm 6 bakınız). Bu yöntemler için, kanat veya üropatagium hafifçe uzatılmalı ve temiz bir biyopsi yumruğu, genellikle çapı 3 mm, örnek elde etmek için kullanılmalıdır. Bu yaklaşım kalıcı bir hasara neden gibi görünüyor, çoğu durumda hafta içinde iyileşiyor yaralarile 24.
HMW DNA (10-150 kb) daha zorludur ve şu anda sadece hasat tan sonra LN2’de hızla yanıp sönen ve ekstraksiyona kadar en fazla -80 °C’de tutulan doku kullanılarak güvenilir bir şekilde elde edilir. HMW DNA (10-150 kb) uzun okunan DNA dizilimi ve dolayısıyla de novo genom montajı için çok önemlidir. Gerçekten de, çoğu ticari kitleri bazı standart HMW DNA izole etmek için kullanılabilir iken, ortaya çıkan molekül boyutları genellikle üçüncü nesil sıralama teknolojilerinin gereksinimlerini karşılamak değil [örneğin, Bu Pasifik Biosciences (PacBio) gibi şirketler tarafından başlatılan, Oxford Nanopore Teknolojileri, ve 10x Genomik, ya da Biyonano Genomik veya Dovetail Genomics tarafından sunulan montaj yöntemleri ile]. Bu nedenle, “ultra HMW” DNA (>150 kb) için yeni bir talep vardır. Yarasalardan ultra HMW DNA elde ederken, karaciğer, beyin veya kas taze örnekleri tüm uygundur, ancak bu hemen herhangi bir depolama tampon veya kriyoprotektif olmadan LN2 dondurulmuş flaş olmalıdır. Bu adımların tam bir açıklaması bu makalenin kapsamı dışındadır, ancak başka bir yerde25mevcuttur.
RNA için doku
RNA, DNA’dan daha az kararlı olan tek iplikçikli bir moleküldür. RNA’nın birçok şekli olmasına rağmen, -omik analizler mRNA (haberci RNA) ve küçük RNA’lara (örneğin mikroRNA’lar) odaklanma eğilimindedir. Transkripsiyondan sonra, mRNA intron içermeyen ve genlerin/genomların kodlama kısmını temsil eden olgun bir transkript oluşturmak üzere birleştirilmiştir. Kodlama genleri genom boyutunun küçük bir kısmını (%1-2) oluşturuyor ve bu da mRNA’nın hedefalınmasını genler için dizi verilerini elde etmek için uygun maliyetli bir araç haline getiriyor. MikroRNA’lar, mRNA’nın proteinlere çevrilme sürecini düzenleyen bir RNA sınıfıdır ve bu nedenle önemli düzenleyici efektörlerdir. RNA transkriptleri tek tek sıralanabilir, ya da daha yaygın olarak -omics analizleri için26,27,28,29,30, bir transkriptom un bir parçası olarak; diğer bir deyişle, belirli bir örnekte bulunan tüm RNA transkriptlerinin toplamıdır.
Sıralama çeşitli yöntemler (yani, kısa okunan RNA-seq veya uzun okunan tüm izoform Seq yoluyla) aşağıdaki yapılabilir, hem RNA bolluğu ve izoform kullanımı analizi sağlayan. mRNA transkriptlerinin miktarı ve çeşitliliği hücreler ve dokular arasında değiştiğinden, RNA dizilemesi gen ekspresyonunu ve regülasyonunun örnekler arasında incelenmesini ve karşılaştırılmasını mümkün kılabilir. Bu yöntemler giderek biyolojik olarak bilgilendirici hale geldikçe, küçük RNA’ların ve bütün isoform sıralamanın sıralanmasına olan ilgi artmaktadır. RNA farklı sınıflarda sıralamak için doku örneklerihazırlanması bu el yazması sunulan aynı şekilde yapılabilir, sadece sonraki çıkarma yöntemleri31,32farklı . Son olarak, transkripsiyonlar protein kodlayan genomun yüksek kapsama alanı alt kümesini sunduğundan, biraraya getirilen veri seti genom montajı ve ek açıklamalarında yararlı olabilir, bu da farklı dokular arasında RNA-seq verilerinin toplanmasını Bat1K girişimi.
DNA’nın aksine, RNA kimyasal olarak kararsızdır ve rna bazlı virüslere karşı savunma stratejisi olarak doku lysates’inde her yerde bulunan RNase enzimleri tarafından da hedef alınır. Bu nedenlerden dolayı, hücre ve dokularda RNA fraksiyonu örnekleme ve/veya ötenazi noktasından kısa bir süre sonra bozulmaya başlar. Bu nedenle RNA’nın korunması, bozulmasını önlemek için adımlar gerektirir. Bu genellikle 4 °C’de taze toplanan dokunun, dokularda doğal olarak bulunan RNa’ları inaktive etmek için RNA stabilizasyon çözeltisi gibi bir stabilizatör ajanda korunmasını ve ardından uzun süreli depolama için dondurulmayı içerir. Tercih edilen bir alternatif olarak, doku LN2 dondurulmuş flaş olabilir; yukarıda belirtildiği gibi, ln2’nin sahaya taşınması ve doku ların erimesini önlemek için seviyelerinin korunması lojistik açıdan zor layıcı olabilir.
Protein için doku
Protein bileşimi ve göreceli bolluk rna için tartışılan benzer bir şekilde hücre ve dokular arasında değişir; ancak proteinler rna’dan ortalama olarak daha kararlıdır. Proteomik kullanılarak protein tanımlaması tipik olarak protein dizisinin bir kısmıyla eşleşir, tam olarak değil, ancak dokular arasında ifade hakkında bilgi sağlayabilir ve mevcut patojenleri karakterize edebilir. Birçok protein dizisi memeliler arasında korunduğundan, proteomik yarasa örnekleri toplama sırasında steril protokoller (örneğin eldivenler, forsepsler) gerektiren korunmuş insan proteinleriyle kolayca kontamine edilebilir. LN2’de parlama dondurma, proteinlerin bozulmasını önlemenin en iyi yolu olsa da, kuru buz, -20 °C’lik dondurucular ve hatta buz başka bir yol yoksa uygundur. Sıcaklıklar arttıkça diferansiyel protein arızası riski de artar. Doku stabilizasyon çözümü gibi stabilizasyon ajanları oda sıcaklığında dokuların protein fraksiyonunun korunmasında etkilidir ve flaş donma uygun olmadığında kısa süreli koruma için uygundur (bir haftaya kadar).
Belirli bir dokunun enzimatik profili doğrudan orada proteinin korunmasını etkiler. Kas gibi düşük enzimatik aktiviteye sahip dokular, ev dondurucuda yüksek sıcaklıklarda bile protein profillerini koruyabilir. Buna karşılık, karaciğer dokusu enzimatik reaktif, ve proteinleri hazırlık sırasında aşağılayıcı yüksek olasılıklar var. Formalin-sabit parafin gömülü (FFPE) örneklerinden insan proteomik profilleri elde etmek için protokollerin giderek artan sayıda dokuların paraformaldehit sabitleme toplama üzerine donma düşük maliyetli protein korunması için söz tutar düşündürmektedir uygulanabilir33,34. Koruma süresine ve durumuna son derece bağlı olmasına rağmen, proteinler formalin-sabit, etanol le korunmuş yarasa örneklerinden immünohistokimya ile tespit edilmiştir35. Bu yaklaşım proteomik düzeyde örnekleme için ölçeklenebilir değildir, ancak flash-donma kullanılamadığında ve diğer stabilizasyon ajanları çok pahalı olduğunda formalin sabit yarasa dokularının protein profilleri verme potansiyelini vurgular.
Hücre kültürü için doku
Örnekleme dokusu ve parlama dondurma kullanılacak sonlu miktarda malzeme sunar ve malzeme kullanıldıktan sonra artık kullanılamaz. Alternatif olarak, hücre kültürleri hemen kullanılabilir veya gelecekteki çalışmalar için korunmuş canlı hücreler sağlar. Kültürler de doku örnekleri küçük olduğunda verimi artırmak için hücrelerin genişlemesini kolaylaştırmak. Özellikle doku toplamanın sınırlı olduğu durumlarda yararlıdır, örneğin öldürücü olmayan örneklemenin gerekli olduğu ve bu nedenle koruma için geniş etkileri olan nadir türlerle yapılan deneyler gibi. Açıklanan hangi hücre kültürü kanat membran dokusunun öldürücü olmayan örnekleme yoluyla mümkün olduğu bir protokol, ancak birden fazla doku tipleri ile culturing mümkündür36,37. Burada sağlanan protokol yapışık hücreler için seçer. Kullanılan kaynak doku ve büyüme ortamının birleşimi bu protokolü fibroblastları seçmek ve büyütmek için uygun hale getirir, ancak istenirse diğer hücre tipleri için alternatif protokoller kullanılabilir. Bat1K projesi kapsamında, nadir ve tehdit altındaki türler için kanat zarlarının öldürücü olmayan örneklemesi ve numunelerin kültürlenme yoluyla genişlemesinin, kullanılan çoklu teknolojiler için gerekli DNA hacmini oluşturmak için gerekli olduğu tahmin edilmektedir5 .
Yarasa yakalama
Yarasaları kullanan tüm insanlar yarasa yetkin bir araştırmacı tarafından eğitilmeli ve bir dizi ön maruziyet enjeksiyonu ile kuduz aşısı yapılmalıdır. Isırılırsa, bir dizi daha maruz kalma sonrası enjeksiyonları hala gereklidir. Yarasaları yakalamak için standart yöntemler sis ağları(Şekil 1) ve arp tuzakları(Şekil 2)içerir. Sis ağları en yaygın olarak kullanılan ve düşük ve orta aktivite ile alanlar için ideal, onlar yarasa sıkıntıen en aza indirmek için en çok bakım gerektiren gibi. Küçük yarasalar özellikle savunmasızdır ve hızlı bir şekilde eğiliminde değilse stresten ölebilir. Sık yapılan net denetimler yarasa yaralanmasını ve mortalitenin yanı sıra sis ağına zarar verebilir. Uygun doku toplama doku taze olmasını gerektirir, çünkü bu ayrıntı önemlidir, ve yarasalar sis ağları nauygun dikkat araştırmacı düzgün örnekleri işlemeden önce gereksiz mortalite veya erken mortaliteye yol açabilir. Birkaç yarasa en az sıkıntı ile bir arp tuzağında dinlenebilir çünkü, bu yaklaşım yüksek yarasa aktivitesi olan alanlar için idealdir, bir mağara veya büyük tünek yakın gibi. Morfolojik ve demografik bilgilerin toplanması için uygun yarasa yakalama ve veri işleme için ayrıntılı talimatlar ek yöntemler mevcuttur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu el yazmasında tartışılan protokol yarasaların çeşitli yüksek işlemmoleküler analizleri için en iyi örnekleme uygulamalarını açıklayınız. Tüm başarılı -omics çalışmaları yüksek kaliteli doku gerektirir, ancak örnekleme yarasa dokusu, yanı sıra diğer model olmayan organizmalar, genellikle kontrollü bir laboratuvar ayarı ile aynı standartlara ayarlanamayan alan koşullarında oluşur. Örnekleme genellikle elektrik ve donduruculara sınırlı erişim de dahil olmak üzere en az kaynaklar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Centro de Ecología y Biodiversidad CEBIO, Erika Paliza, Miluska Sánchez, Jorge Carrera, Edgar Rengifo Vásquez, Harold Porocarrero Zarria, Jorge Ruíz Leveau, Jaime Pecheco Castillo, Carlos Tello, Fanny Cornejo ve Fanny Fernndeáz Melo’ya doku yapımı için teşekkür ederiz. Peru’da toplama mümkün. Ayrıca Dominik Cumhuriyeti’nde doku toplama mümkün hale getirmek için Grupo Jaragua ve Yolanda León tüm üyelerine teşekkür yanı sıra Bernal Rodriguez Hernandez, Bernal Matarrita, ve Kosta Rika La Selva Biyolojik Araştırma İstasyonu’nda herkes, yapmak için örnekleme mümkündür. Biz erişim ve hücre kültürü üretimi için Phyllostomus derenk yarasalar kanat yumruklar örnek toplama için Ella Lattenkamp & Lutz Wiegrebe teşekkür ederiz. Phyllostomus renk değişikliği yarasalar Münih Ludwig-Maximilians-Üniversitesi Bölümü Biyoloji II bir üreme koloni kökenli. Yarasaların bakım ve üremesi için Münih bölge veterinerlik ofisi tarafından onay verildi. LMD, SJR, KTJD ve LRY NSF-DEB 1442142 tarafından finanse edilmiştir. LMD NSF-DEB 1838273 tarafından finanse edilmiştir. LRY NSF-PRFB 1812035 tarafından finanse edilmiştir. SCV ve PH, Max Planck Araştırma Grubu Ödülü ve Human Frontiers Science Program (HFSP) Araştırma hibesi (RGP0058/2016) tarafından finanse edilmiştir. SJR, JHTP ve KTJD, SJR’a verilen Avrupa Araştırma Konseyi (ERC Başlangıç hibesi 310482 [EVOGENO]) tarafından finanse edilmiş, EKT Avrupa Araştırma Konseyi hibesi (ERC-2012-StG311000) tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| 1.5 mL Eppendorf Safelock tubes | Fischer Scientific | 10509691 | 1.5 mL sterile tubes used during cell culture protocol |
| 15 mL tubes | Sarstedt | 62,554,002 | 15 mL sterile tubes used during cell culture protocol |
| 2 mL cryovials | Thomas Scientific | 1154P75 | cryogenic vials for tissues to be stored in liquid nitrogen |
| 3-mm biopsy punch | Medline | MIL3332 | wing biopsy punch for cell culture |
| 6 well plate | Greiner | 83,392 | Culture vessle |
| Allprotect Tissue Reagent | Qiagen | 76405 | for fecal samples; tissue stabilizing solution |
| Cell counting slides for TC10/TC20 cell counter, dual chamber | Bio-Rad | 145-0011 | Chambers for the count cells using the automated cell counter TC20 by Bio-Rad |
| collagenase IV | Stemcell Technologies | 7909 | For dissociation of primary cells |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650-5X5ML | Prevents crystalization of water during freezing of the cells. |
| DMEM–Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher | 12491-015 | culture media |
| Dulbecco's PBS | Invitrogen | 14190169 | Balanced salt solution used for washing cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Fischer Scientific | 10270106 | Serum-supplement for in vitro cell culture of eukaryotic cells |
| Gentamycin sulfate salt | Sigma Aldrich | G1264-250MG | Antibiotic for culture media |
| Nalgene Mr. Frosty | Thermo Scientific | 5100-0050 | Freezing container which provides 1°C/min cooling rate |
| PARAFILM | Sigma | P7793 | Wrapping tubes etc for sealing |
| Penicillin-streptomycin (pen-strep), 100x | Invitrogen | 15140130 | Antibiotic for culture media |
| Phosphate-buffered saline (PBS) 10x, pH 7.4 | Thermo Fisher | 10010023 | salt buffer used for washes and storage of bone tissue; dilute to 10X using de-ionized water |
| RNAlater | Thermo Fisher | AM7021 | RNA stabilizing solution |
| RNAse away | Genetech | 83931-250mL | breaks down enzymes that lead to RNA degradation |
| Silica gel | Fisher Scientific | 7631-86-9 | dessicant agent |
| TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | 1450102 | Automated cell counter |
| Trypan blue | Bio-Rad | 145-0013 | Cell stain used to assess cell viability |
| trypsin-EDTA | Sigma Aldrich | T4049 | For dissociation of cells during splitting |
References
- Jiao, W. B., Schneeberger, K. The impact of third generation genomic technologies on plant genome assembly. Current Opinion in Plant Biology. 36, 64-70 (2017).
- van Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Naquin, D., Thermes, C. The third revolution in sequencing technology. Trends in Genetics. 34 (9), 666-681 (2018).
- Lee, H., et al. Third-generation sequencing and the future of genomics. bioRxiv. , 048603 (2016).
- Mayjonade, B., et al. Extraction of high-molecular-weight genomic DNA for long-read sequencing of single molecules. BioTechniques. 62 (1), xv (2017).
- Teeling, E., et al. Bat biology, genomes, and the Bat1K project: To generate chromosome-level genomes for all living bat species. Annual Review of Animal Biosciences. 6 (12), 1-24 (2018).
- Jones, G., Teeling, E. C., Rossiter, S. J. From the ultrasonic to the infrared: molecular evolution and the sensory biology of bats. Frontiers in Physiology. 4 (117), 1-16 (2013).
- Vincenot, C. E., Florens, F. B. V., Kingston, T. Can we protect island flying foxes. Science. 355 (6332), 1368-1370 (2017).
- Blehert, D. S., et al. Bat white-nose syndrome: An emerging fungal pathogen?. Science. 323 (5911), 227 (2009).
- Foley, J., Clifford, D., Castle, K., Cryan, P., Ostfeld, R. S. Investigating and managing the rapid emergence of White Nose Syndrome, a novel, fatal, infectious disease of hibernating bats. Conservation Biology. 25 (2), 223-231 (2011).
- Foley, N. M., et al. Growing old, yet staying young: The role of telomeres in bats’ exceptional longevity. Science Advances. 4, (2018).
- Dammann, P. Slow aging in mammals—Lessons from African mole-rats and bats. Seminars in Cell and Developmental Biology. 70, 154-163 (2017).
- Tsagkogeorga, G., Parker, J., Stupka, E., Cotton, J. A., Rossiter, S. J. Phylogenomic analyses elucidate the evolutionary relationships of bats. Current Biology. 23 (22), 2262-2267 (2013).
- Rohland, N., Reich, D. C. o. s. t. -. e. f. f. e. c. t. i. v. e. high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome Research. 22 (5), 939-946 (2012).
- Yohe, L. R., et al. Trpc2 pseudogenization dynamics in bats reveal ancestral vomeronasal signaling, then pervasive loss. Evolution. 71 (4), 923-935 (2017).
- Shen, B., Han, X., Zhang, J., Rossiter, S. J., Zhang, S. Adaptive evolution in the glucose transporter 4 gene Slc2a4 in Old World fruit bats (family: Pteropodidae). PLoS ONE. 7 (4), e33197 (2012).
- Rojas, D., Warsi, O. M., Dávalos, L. M. Bats (Chiroptera: Noctilionoidea) challenge a recent origin of extant neotropical diversity. Systematic Biology. 65 (3), 432-448 (2016).
- Vonhof, M. J., Russell, A. L. Genetic approaches to the conservation of migratory bats: a study of the eastern red bat (Lasiurus borealis). PeerJ. 3, e983 (2015).
- Korstian, J. M., Schildt, A. J., Bennett, V. J., Williams, D. A., Hale, A. M. A method for PCR-based identification of bat species from fecal samples. Conservation Genetics Resources. 7 (4), 803-806 (2015).
- Bailey, S. E., et al. The use of museum samples for large-scale sequence capture: A study of congeneric horseshoe bats (family Rhinolophidae). Biological Journal of the Linnean Society. 117 (1), 58-70 (2016).
- Boston, E. S. M., et al. Empirical assessment of non-invasive population genetics in bats: Comparison of DNA quality from faecal and tissue samples. Acta Chiropterologica. 14 (1), 45-52 (2012).
- Puechmaille, S. J., Mathy, G., Petit, E. J. Good DNA from bat droppings. Acta Chiropterologica. 9 (1), 237-249 (2007).
- Corthals, A., et al. From the field to the lab: Best practices for field preservation of bat specimens for molecular analyses. PLoS ONE. 10 (3), 1-12 (2015).
- Kacprzyk, J., Teeling, E. C., Kelleher, C., Volleth, M. Wing membrane biopsies for bat cytogenetics: Finding of 2n = 54 in Irish Rhinolophus hipposideros (Rhinolophidae, Chiroptera, Mammalia) supports two geographically separated chromosomal variants in Europe. Cytogenetic and Genome Research. 148 (4), 279-283 (2016).
- Greville, L. J., Ceballos-Vasquez, A., Valdizón-Rodríguez, R., Caldwell, J. R., Faure, P. A. Wound healing in wing membranes of the Egyptian fruit bat (Rousettus aegyptiacus) and big brown bat (Eptesicus fuscus). Journal of Mammalogy. 99 (4), 974-982 (2018).
- Green, M. R., Sambrook, J. Isolation and quantification of DNA. Cold Spring Harbor Protocols. 6 (6), 403-414 (2018).
- Shaw, T. I., et al. Transcriptome sequencing and annotation for the Jamaican fruit bat (Artibeus jamaicensis). PLoS one. 7 (11), e48472 (2012).
- Seim, I., et al. Genome analysis reveals insights into physiology and longevity of the Brandt’s bat Myotis brandtii. Nature communications. 4, 2212 (2013).
- Lei, M., Dong, D., Mu, S., Pan, Y. H., Zhang, S. Comparison of brain transcriptome of the greater horseshoe bats (Rhinolophus ferrumequinum) in active and torpid episodes. PLoS ONE. 9 (9), (2014).
- Lee, A. K., et al. De novo transcriptome reconstruction and annotation of the Egyptian rousette bat. BMC Genomics. 16 (1), 1-11 (2015).
- Francischetti, I. M. B., et al. The “Vampirome”: Transcriptome and proteome analysis of the principal and accessory submaxillary glands of the vampire bat Desmodus rotundus, a vector of human rabies. Journal of Proteomics. 82, 288-319 (2013).
- Wen, M., et al. Exploring the genome and transcriptome of the cave nectar bat Eonycteris spelaea with PacBio long-read sequencing. GigaScience. (September), 1-8 (2018).
- Gonzalez-Garay, M. L. Introduction to isoform sequencing using pacific biosciences technology (Iso-Seq). Transcriptomics and Gene Regulation. , 141-160 (2016).
- Paulo, J. A., Lee, L. S., Banks, P. A., Steen, H., Conwell, D. L. Proteomic analysis of formalin-fixed paraffin-embedded pancreatic tissue using liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Pancreas. 41 (2), 175 (2012).
- Wiśniewski, J. R. Proteomic sample preparation from formalin fixed and paraffin embedded tissue. Journal of visualized experiments: JoVE. (79), (2013).
- Sadier, A., et al. Evidence for multifactorial processes underlying phenotypic variation in bat visual opsins. bioRxiv. , 300301 (2018).
- Sotero-Caio, C. G., et al. Integration of molecular cytogenetics, dated molecular phylogeny, and model-based predictions to understand the extreme chromosome reorganization in the Neotropical genus Tonatia (Chiroptera: Phyllostomidae). BMC Evolutionary Biology. 15 (1), 1-15 (2015).
- Baker, R. J., Hamilton, M. J., Parish, D. A. . Preparations of mammalian karyotypes under field conditions. , (2003).
- Song, H., Buhay, J. E., Whiting, M. F., Crandall, K. A. Many species in one: DNA barcoding overestimates the number of species when nuclear mitochondrial pseudogenes are coamplified. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (36), 13486-13491 (2008).
- Pooniya, S., Lalwani, S., Raina, A., Millo, T., Das Dogra, T. Quality and quantity of extracted deoxyribonucleic Acid (DNA) from preserved soft tissues of putrefied unidentifiable human corpse. Journal of Laboratory Physicians. 6 (1), 31 (2014).
- Camacho-Sanchez, M., Burraco, P., Gomez-Mestre, I., Leonard, J. A. Preservation of RNA and DNA from mammal samples under field conditions. Molecular Ecology Resources. 13, 663-673 (2013).
- Phelan, K., May, K. M. Basic techniques in mammalian cell tissue culture. Current Protocols in Cell Biology. 66 (1), 1 (2015).
- Database, J. S. E. Using a hemacytometer to count cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2018).
- Dávalos, L. M., Velazco, P. M., Warsi, O. M., Smits, P. D., Simmons, N. B. Integrating incomplete fossils by isolating conflicting signal in saturated and non-independent morphological characters. Systematic Biology. 63 (4), 582-600 (2014).
- Schroeder, A., et al. The RIN: An RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 1-14 (2006).
- Mueller, O., Lightfoot, S., Schroeder, A. RNA Integrity Number (RIN)-Standarization of RNA quality control. Nano. , 1-17 (2004).
- Leary, S., et al. . AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. , (2013).
- Sampaio-Silva, F., Magalhães, T., Carvalho, F., Dinis-Oliveira, R. J., Silvestre, R. Profiling of RNA degradation for estimation of post morterm interval. PLoS ONE. 8 (2), (2013).
- Hecht, A. M., Braun, B. C., Krause, E., Voigt, C. C., Greenwood, A. D., Czirják, G. Plasma proteomic analysis of active and torpid greater mouse-eared bats (Myotis myotis). Scientific Reports. 5, 1-10 (2015).
- Ball, H. C., Levari-Shariati, S., Cooper, L. N., Aliani, M. Comparative metabolomics of aging in a long-lived bat: Insights into the physiology of extreme longevity. PLoS ONE. 13 (5), 1-20 (2018).
- Kacprzyk, J., et al. A potent anti-inflammatory response in bat macrophages may be linked to extended longevity and viral tolerance. Acta Chiropterologica. 19 (2), 219-228 (2017).
- Littlefair, J. E., Clare, E. L. Barcoding the food chain: from Sanger to high-throughput sequencing. Genome. 59 (11), 946-958 (2016).
- Phillips, C. D., et al. Microbiome analysis among bats describes influences of host phylogeny, life history, physiology and geography. Molecular Ecology. 21 (11), 2617-2627 (2012).
- Carrillo-Araujo, M., et al. Phyllostomid bat microbiome composition is associated to host phylogeny and feeding strategies. Frontiers in Microbiology. 6 (May), 1-9 (2015).
- Hughes, G. M., Leech, J., Puechmaille, S. J., Lopez, J. V., Teeling, E. C. Is there a link between aging and microbiome diversity in exceptional mammalian longevity?. PeerJ. 6, e4174 (2018).
- Pannkuk, E. L., et al. Fatty acid methyl ester profiles of bat wing surface lipids. Lipids. 49 (11), 1143-1150 (2014).
- Pannkuk, E. L., et al. Glycerophospholipid profiles of bats with white-nose syndrome. Physiological and Biochemical Zoology. 88 (4), 425-432 (2015).
