Patient-afledt heterogene xenograft model af kræft i bugspytkirtlen ved hjælp af Zebrafish larver som værter for sammenlignende Lægemiddelvurdering
Summary
Denne protokol beskriver optimerings procedurer i en virus baseret Dual fluorescens-mærket tumor xenograft model ved hjælp af larve Zebra som værter. Denne heterogene xenograft model efterligner vævet sammensætning af bugspytkirtelkræft mikromiljø in vivo og fungerer som et mere præcist redskab til vurdering af narkotika respons i personlige zPDX (zebrafish patient-afledte xenograft) modeller.
Abstract
Patient-afledte tumor xenograft (PDX) og celle-afledte tumor xenograft (CDX) er vigtige teknikker til præklinisk vurdering, medicin vejledning og grundlæggende kræft forsker. Generationer af PDX-modeller i traditionelle værts-mus er tidskrævende og arbejder kun for en lille del af prøverne. For nylig, zebra PDX (zpdx) er dukket op som et unikt værtssystem, med de karakteristiske træk ved lille skala og høj effektivitet. Her beskriver vi en optimeret metode til generering af en dobbelt fluorescens-mærket tumor xenograft model til sammenlignende kemoterapi vurdering i zPDX modeller. Tumor celler og fibroblaster blev beriget fra nyhøstet eller frosset bugspytkirtel Cancer væv på forskellige dyrkningsbetingelser. Begge celle grupper blev mærket af lentivirus, der udtrykker grønne eller røde fluorescerende proteiner, samt en anti-apoptose-gen BCL2L1. De transficeret celler blev præ-blandet og co-injiceres i 2 DPF larve zebra, som derefter blev opdrættet i modificeret E3 medium ved 32 °c. Xenograft-modellerne blev behandlet med kemoterapi-lægemidler og/eller BCL2L1-hæmmer, og overvejelserne af både tumorceller og fibroblaster blev undersøgt samtidigt. Kort sagt, denne protokol giver forskerne mulighed for hurtigt at generere en stor mængde af zPDX modeller med en heterogene tumor mikromiljø og giver en længere observation vindue og en mere præcis kvantitation i vurderingen af effektiviteten af narkotika kandidater.
Introduction
Precision onkologi har til formål at finde de mest gavnlige terapeutiske strategier for den enkelte patient1. I øjeblikket foreslås talrige prækliniske modeller såsom in vitro primær kultur, in vitro organoid Culture2og patient afledte xenografter (PDX) i mus før eller efter organoid-kulturen til diagnosticering og til at screene/vurdere de potentielle terapeutiske valg3. PDX model genereret ved injektion af humane primære kræftceller i immunkompromitterede mus, er en af de mest lovende værktøjer til personlig Drug screening i klinisk onkologi3,4. I modsætning til den dyrkede cellelinje in vitro bevarer PDX-modeller normalt integriteten og heterogeniteten af in vivo-tumor miljøet, bedre efterligner mangfoldigheden og idiosynkratiske egenskaber hos forskellige tumor patienter, og kan derfor forudsige potentielt medicinsk udfald af patienter4. Men genereringen af PDX-modeller i mus kræver patientprøver af høj kvalitet og måneders tid til at samle tilstrækkelige celler og modeller til multi gruppe eksperimenter, og xenograft-cellernes cellulære/genetiske sammensætning kan glide fra de oprindelige patientensbiopsi. Succesraten for etablering af mus PDX-modellen er også lav, hvilket gør det vanskeligt at være bredt implementeret i klinisk praksis. For de patienter, der transporterer hurtigt progredierede kræftformer som kræft i bugspytkirtlen, de kan ikke være i stand til at få værdifulde oplysninger fra PDX eksperimenter i tide.
I de sidste par år, zebra er blevet rapporteret at være potentielle værter for ikke kun cdx (celle-afledte tumor xenograft) modeller, men også PDX modeller5,6,7,8,9, 10. som en hvirveldyr model dyr, zebra havne tilstrækkelig ligheder med pattedyr i både genetik og fysiologi, med to betydelige fordele: gennemsigtighed og små i størrelse11. Zebrafish er også meget afføring, og hundredvis af indavlede larver kan opnås inden for få dage fra et enkelt par voksne12. Flere undersøgelser har ansat Zebra til at generere både transgene og xenograft modeller af kræft sygdomme13,14. Sammenlignet med mus xenografter, zebra xenografter tillader sporing ved enkelt celle opløsning. En vis mængde af humane væv er i stand til at generere hundredvis af Zebra PDX modeller (zpdxs), mens kan kun være tilstrækkelig til at generere et par mus PDX modeller15,16. Udover, den Zebra larver på 2-5 DPF allerede udvikle komplette kredsløbssygdomme og metaboliske organer såsom lever og nyrer, men ikke immunsystemet17, mens den resterende æggeblomme SAC er en naturlig 3D medium, ideel til Drug screening, narkotika resistens tests og tumor migration observationer6,18,19,20,21.
Med et ultimativt forsøg på at bruge zPDX som en screening/test platform til klinisk brug, her beskriver vi et optimeret forslag til zPDX model af kræft i bugspytkirtlen, som tillader in vivo kandidat Drug vurdering inden for kort tid ved hjælp af færre celler til lavere omkostninger. Sammenlignet med de tidligere referencer om zpdx6,9,10, introducerede vi flere optimeringer for at gøre systemet mere gennemførligt og pålideligt for klinisk personlig diagnose: 1) præsortering af forskellige celler grupper i den primære tumor væv og stabiliserende primærceller i en uge før yderligere forsøg; 2) mærkning af humane celler og øge cellens levedygtighed i xenograft via lentivirus-baseret genetisk modifikation; 3) optimering af Zebra-kulturen i både ernæringstilskud (glucose og glutamin) og temperatur; 4) kvantificering af lægemiddel responser af forskellige celletyper på en komparativ måde. Vi har også foretaget ændringer i injektionsopløsningen ved at tilføje flere supplerende materialer. I alt, disse forbedringer giver mulighed for hurtigt at generere en mere patient-lignende xenograft i Zebra værter, der kan bruges som et pålideligt redskab til at vurdere reaktionen af kandidat medicin.
Protocol
Representative Results
Discussion
Både PDX-og CDX-modellerne er vitale platforme inden for tumor biologi22, og det kritiske trin i en vellykket transplantation af Inter-arter er at forbedre xenograft overlevelse. For nylig har nogle undersøgelser vist, at forbigående ekspression af BCL2L1 (BCL-XL) eller BCL2 i væsentlig grad kan forbedre levedygtigheden af humane embryonale stamceller i mus værter uden at påvirke celle identiteter og skæbner23 , <sup class="xre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China 81402582, Natural Science Foundation i Shanghai 12DZ2295100, 14YF1400600 og 18ZR1404500
Materials
| DMEM | GIBCO | C11995500BT | |
| FBS | Hyclone | sv30087.03 | |
| Y-27632 | Cliniscience | Y0503 | Rho kinase inhibitor |
| Primocin | invivogen | ant-pm-1 | an antibiotic for primary cell cultures |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Nicotinamide | Sigma | N3376 | |
| penicillin streptomycin | GIBCO | 15140122.00 | |
| phosphate buffer (PBS) | GIBCO | C10010500CP | |
| HBSS | GIBCO | 14170112.00 | |
| collagenase type IV | GIBCO | 17104019.00 | |
| hyaluronidase | Sigma | H3884 | |
| DnaseⅠ | Sigma | D5025 | |
| insulin | Sigma | I9278 | |
| b-FGF | GIBCO | PHG0264 | |
| EGF | GIBCO | PHG0314 | |
| pancreatic cancer fibroblasts inhibitor | CHI Scientific | FibrOUT | |
| 0.45 μm sterile filter | Millipore | SLHV033RB | |
| concentration column | Millipore | Millipore UFC910008 | Concentrate the virus |
| polybrene | Sigma | H9268 | |
| Hyaluronic Acid Sodium Salt | Sigma | H7630 | |
| L-glutamine | GIBCO | 21051024.00 | |
| gemcitabine | Gemzan | ||
| methylcellulose | Sigma | M0262 | |
| Navitoclax(ABT-263) | Selleck | S1001 | Bcl-xL inhibitor |
| Equipment | |||
| Microinjector | NARISHIGE | ||
| stereomicroscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Confocal Microscope | LEICA | SP8 | 0.00 |
References
- Collins, D. C., Sundar, R., Lim, J. S. J., Yap, T. A. Towards Precision Medicine in the Clinic: From Biomarker Discovery to Novel Therapeutics. Trends in Pharmacological Sciences. 38 (1), 25-40 (2017).
- Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell- and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).
- Pauli, C., et al. Personalized In Vitro and In Vivo Cancer Models to Guide Precision Medicine. Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research. Cancer Research and Treatment. 50 (1), 1-10 (2018).
- Fior, R., et al. Single-cell functional and chemosensitive profiling of combinatorial colorectal therapy in zebrafish xenografts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (39), E8234-E8243 (2017).
- Chen, L., et al. A zebrafish xenograft model for studying human cancer stem cells in distant metastasis and therapy response. Methods in Cell Biology. 138, 471-496 (2017).
- Gaudenzi, G., et al. Patient-derived xenograft in zebrafish embryos: a new platform for translational research in neuroendocrine tumors. Endocrine. 57 (2), 214-219 (2017).
- Lee, J. Y., Mazumder, A., Diederich, M. Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts. Journal of Visualized Experiment. (136), (2018).
- Zhang, M., et al. Adipocyte-Derived Lipids Mediate Melanoma Progression via FATP Proteins. Cancer Discovery. 8 (8), 1006-1025 (2018).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews: Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
- Guo, M., et al. U0126 inhibits pancreatic cancer progression via the KRAS signaling pathway in a zebrafish xenotransplantation model. Oncology Reports. 34 (2), 699-706 (2015).
- Yao, Y., et al. Canonical Wnt Signaling Remodels Lipid Metabolism in Zebrafish Hepatocytes following Ras Oncogenic Insult. Cancer Research. 78 (19), 5548-5560 (2018).
- Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. Hooking the big one: the potential of zebrafish xenotransplantation to reform cancer drug screening in the genomic era. Disease Models & Mechanisms. 7 (7), 745-754 (2014).
- Zon, L. I., Peterson, R. The new age of chemical screening in zebrafish. Zebrafish. 7 (1), 1 (2010).
- Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Developmental & Comparative Immunology. 28 (1), 9-28 (2004).
- Mercatali, L., et al. Development of a Patient-Derived Xenograft (PDX) of Breast Cancer Bone Metastasis in a Zebrafish Model. International Journal of Molecular Sciences. 17 (8), (2016).
- Wu, J. Q., et al. Patient-derived xenograft in zebrafish embryos: a new platform for translational research in gastric cancer. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 36 (1), 160 (2017).
- Tulotta, C., et al. Imaging Cancer Angiogenesis and Metastasis in a Zebrafish Embryo Model. Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 239-263 (2016).
- Yao, Y., et al. Screening in larval zebrafish reveals tissue-specific distributions of fifteen fluorescent compounds. Disease Model& Mechanisms. , 028811 (2017).
- Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nature Reviews: Clinical Oncology. 9 (6), 338-350 (2012).
- Charo, J., et al. Bcl-2 overexpression enhances tumor-specific T-cell survival. Cancer Research. 65 (5), 2001-2008 (2005).
- Wang, X., et al. Human embryonic stem cells contribute to embryonic and extraembryonic lineages in mouse embryos upon inhibition of apoptosis. Cell Research. 28 (1), 126-129 (2018).
- Boise, L. H., et al. bcl-x, a bcl-2-related gene that functions as a dominant regulator of apoptotic cell death. Cell. 74 (4), 597-608 (1993).
- Moore, J. C., et al. Single-cell imaging of normal and malignant cell engraftment into optically clear prkdc-null SCID zebrafish. Journal of Experimental Medicine. 213 (12), 2575-2589 (2016).
