Este protocolo descreve procedimentos da optimização em um modelo fluorescência-etiquetado duplo baseado em vírus do xenograft do tumor usando o zebrafish larval como anfitriões. Este modelo heterogêneo do xenograft imita a composição do tecido do microambiente pancreatic do cancro in vivo e sere como uma ferramenta mais precisa para avaliar respostas da droga em modelos personalizados de zPDX (xenograft paciente-derivado de zebrafish).
O xenograft paciente-derivado do tumor (PDX) e o xenograft pilha-derivado do tumor (CDX) são técnicas importantes para a avaliação pré-clínica, a orientação da medicamentação e as pesquisas básicas do cancro. Gerações de modelos PDX em camundongos hospedeiros tradicionais são demoradas e só trabalham para uma pequena proporção de amostras. Recentemente, zebrafish PDX (zPDX) surgiu como um sistema de acolhimento único, com as características de pequena escala e de alta eficiência. Aqui, nós descrevemos uma metodologia aperfeiçoada para gerar um modelo fluorescência-etiquetado duplo do xenograft do tumor para a avaliação comparativa da quimioterapia em modelos de zPDX. As pilhas e os fibroblasto do tumor foram enriquecidos do tecido pancreatic recentemente-colhido ou congelado do cancro em condições diferentes da cultura. Ambos os grupos celulares foram rotulados por Lentivirus expressando proteínas fluorescentes verde ou vermelha, bem como um gene BCL2L1. As células transfectadas foram pré-misturadas e coinjetadas no zebrafish larval 2 DPF que foram então criados em meio E3 modificado a 32 ° c. Os modelos do xenograft foram tratados por drogas da quimioterapia e/ou pelo inibidor de BCL2L1, e as viabilidades de pilhas e de fibroblastos do tumor foram investigadas simultaneamente. Em resumo, este protocolo permite que os investigadores gerem rapidamente uma grande quantidade de modelos de zPDX com um microambiente heterogêneo do tumor e forneça uma janela mais longa da observação e uma quantitação mais precisa em avaliar a eficiência de candidatos da droga.
A Oncologia de precisão tem como objetivo encontrar as estratégias terapêuticas mais benéficas para o paciente individual1. Atualmente, inúmeros modelos pré-clínicos como a cultura primária in vitro, a cultura organoide in vitro2e os xenoenxertos derivados do paciente (PDX) em camundongos antes ou depois da cultura organoide são propostos para o diagnóstico e para a tela/avaliação do potencial escolhas terapêuticas3. O modelo PDX gerado pela injeção de células cancerosas primárias humanas em camundongos imunocomprometidos é uma das ferramentas mais promissoras para a triagem personalizada de fármacos em oncologia clínica3,4. Diferentemente da linhagem celular cultivada in vitro, os modelos PDX geralmente preservam a integridade e a heterogeneidade do ambiente tumoral in vivo, imitando melhor a diversidade e as características idiossincráticas de diferentes pacientes tumorais e, portanto, podem prever a resultados médicos potenciais dos doentes4. No entanto, a geração de modelos PDX em camundongos requer amostras de pacientes de alta qualidade e meses de tempo para reunir células e modelos suficientes para experimentos em vários grupos, e as composições celulares/genéticas do Xenoenxerto podem derivar das do original biópsiado paciente. A taxa de sucesso para o estabelecimento de camundongos PDX modelo também é baixa, tornando difícil de ser amplamente implementado na prática clínica. Para os pacientes que transportam cânceres rapidamente progredidos como câncer pancreático, eles podem não ser capazes de obter informações valiosas dos experimentos PDX no tempo.
Nos últimos anos, zebrafish foi relatado para ser anfitriões potenciais para não somente CDX (pilha-derivado xenograft do tumor) modela, mas também PDX modela5,6,7,8,9, 10. como um animal modelo vertebrado, o zebrafish abriga semelhanças suficientes com mamíferos em genética e fisiologia, com duas vantagens significativas: transparência e pequeno tamanho11. O zebrafish também é altamente fecundidade, e centenas de larvas inpuras podem ser obtidas dentro de poucos dias a partir de um único par de adultos12. Vários estudos têm empregado zebrafish para gerar modelos transgênicos e xenoenxertos de doenças cancerosas13,14. Comparado aos xenoenxertos de camundongos, os xenoenxertos de zebrafish permitem o rastreamento em uma resolução de célula única. Uma certa quantidade de tecidos humanos é capaz de gerar centenas de modelos de zebrafish PDX (zpdxs), enquanto só pode ser suficiente para gerar um par de ratos PDX modelos15,16. Além disso, as larvas de zebrafish em 2-5 DPF já desenvolvem sistemas circulatórios completos e órgãos metabólicos, como fígado e rim, mas não o sistema imunológico17, enquanto o saco de gema remanescente é um meio natural 3D, ideal para triagem de drogas, drogas testes de resistência e observações de migração tumoral6,18,19,20,21.
Com uma tentativa final de usar zPDX como uma plataforma de triagem/teste para uso clínico, aqui, descrevemos uma proposta otimizada para o modelo zPDX de câncer pancreático, que permite a avaliação in vivo do candidato a drogas dentro de um curto espaço de tempo usando menos células a custos mais baixos. Comparado com as referências anteriores sobre zpdx6,9,10, introduzimos várias otimizações para tornar o sistema mais viável e confiável para o diagnóstico clínico personalizado: 1) pré-classificação de células diferentes grupos nos tecidos primários do tumor e estabilizando as células primárias por uma semana antes de novas experiências; 2) rotular as células humanas e melhorar a viabilidade celular em Xenoenxerto via modificação genética baseada em Lentivirus; 3) otimizando a condição de cultura zebrafish em ambos os suplementos de nutrição (glicose e glutamina) e temperatura; 4) quantificando as respostas medicamentosas de diferentes tipos de células de forma comparativa. Também fizemos alterações na solução de injeção adicionando vários materiais complementares. Ao todo, essas melhorias proporcionam a possibilidade de gerar rapidamente um Xenoenxerto mais paciente-like em hospedeiros zebrafish que podem ser usados como uma ferramenta confiável para avaliar a resposta dos medicamentos candidatos.
Ambos os modelos PDX e CDX são plataformas vitais no campo da biologia tumoral22, e o passo crítico de um transplante de sucesso entre espécies é melhorar a sobrevida do Xenoenxerto. Recentemente, alguns estudos mostraram que a expressão transitória de BCL2L1 (BCL-XL) ou BCL2 pode melhorar significativamente a viabilidade de células-tronco embrionárias humanas em hospedeiros de camundongos sem afetar as identidades celulares e destinos23…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de ciências naturais da China 81402582, Fundação de ciência natural de Xangai 12DZ2295100, 14YF1400600 e 18ZR1404500
DMEM | GIBCO | C11995500BT | |
FBS | Hyclone | sv30087.03 | |
Y-27632 | Cliniscience | Y0503 | Rho kinase inhibitor |
Primocin | invivogen | ant-pm-1 | an antibiotic for primary cell cultures |
Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
Nicotinamide | Sigma | N3376 | |
penicillin streptomycin | GIBCO | 15140122.00 | |
phosphate buffer (PBS) | GIBCO | C10010500CP | |
HBSS | GIBCO | 14170112.00 | |
collagenase type IV | GIBCO | 17104019.00 | |
hyaluronidase | Sigma | H3884 | |
DnaseⅠ | Sigma | D5025 | |
insulin | Sigma | I9278 | |
b-FGF | GIBCO | PHG0264 | |
EGF | GIBCO | PHG0314 | |
pancreatic cancer fibroblasts inhibitor | CHI Scientific | FibrOUT | |
0.45 μm sterile filter | Millipore | SLHV033RB | |
concentration column | Millipore | Millipore UFC910008 | Concentrate the virus |
polybrene | Sigma | H9268 | |
Hyaluronic Acid Sodium Salt | Sigma | H7630 | |
L-glutamine | GIBCO | 21051024.00 | |
gemcitabine | Gemzan | ||
methylcellulose | Sigma | M0262 | |
Navitoclax(ABT-263) | Selleck | S1001 | Bcl-xL inhibitor |
Equipment | |||
Microinjector | NARISHIGE | ||
stereomicroscope | OLYMPUS | MVX10 | |
Confocal Microscope | LEICA | SP8 | 0.00 |