Modelo de Xenoenxerto heterogêneo derivado do paciente do câncer pancreático usando larvas de zebrafish como hospedeiros para avaliação comparativa de fármacos

Summary

Este protocolo descreve procedimentos da optimização em um modelo fluorescência-etiquetado duplo baseado em vírus do xenograft do tumor usando o zebrafish larval como anfitriões. Este modelo heterogêneo do xenograft imita a composição do tecido do microambiente pancreatic do cancro in vivo e sere como uma ferramenta mais precisa para avaliar respostas da droga em modelos personalizados de zPDX (xenograft paciente-derivado de zebrafish).

Abstract

O xenograft paciente-derivado do tumor (PDX) e o xenograft pilha-derivado do tumor (CDX) são técnicas importantes para a avaliação pré-clínica, a orientação da medicamentação e as pesquisas básicas do cancro. Gerações de modelos PDX em camundongos hospedeiros tradicionais são demoradas e só trabalham para uma pequena proporção de amostras. Recentemente, zebrafish PDX (zPDX) surgiu como um sistema de acolhimento único, com as características de pequena escala e de alta eficiência. Aqui, nós descrevemos uma metodologia aperfeiçoada para gerar um modelo fluorescência-etiquetado duplo do xenograft do tumor para a avaliação comparativa da quimioterapia em modelos de zPDX. As pilhas e os fibroblasto do tumor foram enriquecidos do tecido pancreatic recentemente-colhido ou congelado do cancro em condições diferentes da cultura. Ambos os grupos celulares foram rotulados por Lentivirus expressando proteínas fluorescentes verde ou vermelha, bem como um gene BCL2L1. As células transfectadas foram pré-misturadas e coinjetadas no zebrafish larval 2 DPF que foram então criados em meio E3 modificado a 32 ° c. Os modelos do xenograft foram tratados por drogas da quimioterapia e/ou pelo inibidor de BCL2L1, e as viabilidades de pilhas e de fibroblastos do tumor foram investigadas simultaneamente. Em resumo, este protocolo permite que os investigadores gerem rapidamente uma grande quantidade de modelos de zPDX com um microambiente heterogêneo do tumor e forneça uma janela mais longa da observação e uma quantitação mais precisa em avaliar a eficiência de candidatos da droga.

Introduction

A Oncologia de precisão tem como objetivo encontrar as estratégias terapêuticas mais benéficas para o paciente individual¹. Atualmente, inúmeros modelos pré-clínicos como a cultura primária in vitro, a cultura organoide in vitro²e os xenoenxertos derivados do paciente (PDX) em camundongos antes ou depois da cultura organoide são propostos para o diagnóstico e para a tela/avaliação do potencial escolhas terapêuticas³. O modelo PDX gerado pela injeção de células cancerosas primárias humanas em camundongos imunocomprometidos é uma das ferramentas mais promissoras para a triagem personalizada de fármacos em oncologia clínica^3,4. Diferentemente da linhagem celular cultivada in vitro, os modelos PDX geralmente preservam a integridade e a heterogeneidade do ambiente tumoral in vivo, imitando melhor a diversidade e as características idiossincráticas de diferentes pacientes tumorais e, portanto, podem prever a resultados médicos potenciais dos doentes⁴. No entanto, a geração de modelos PDX em camundongos requer amostras de pacientes de alta qualidade e meses de tempo para reunir células e modelos suficientes para experimentos em vários grupos, e as composições celulares/genéticas do Xenoenxerto podem derivar das do original biópsiado paciente. A taxa de sucesso para o estabelecimento de camundongos PDX modelo também é baixa, tornando difícil de ser amplamente implementado na prática clínica. Para os pacientes que transportam cânceres rapidamente progredidos como câncer pancreático, eles podem não ser capazes de obter informações valiosas dos experimentos PDX no tempo.

Nos últimos anos, zebrafish foi relatado para ser anfitriões potenciais para não somente CDX (pilha-derivado xenograft do tumor) modela, mas também PDX modela^5,6,^{7,8,9, 10}. como um animal modelo vertebrado, o zebrafish abriga semelhanças suficientes com mamíferos em genética e fisiologia, com duas vantagens significativas: transparência e pequeno tamanho¹¹. O zebrafish também é altamente fecundidade, e centenas de larvas inpuras podem ser obtidas dentro de poucos dias a partir de um único par de adultos¹². Vários estudos têm empregado zebrafish para gerar modelos transgênicos e xenoenxertos de doenças cancerosas^13,14. Comparado aos xenoenxertos de camundongos, os xenoenxertos de zebrafish permitem o rastreamento em uma resolução de célula única. Uma certa quantidade de tecidos humanos é capaz de gerar centenas de modelos de zebrafish PDX (zpdxs), enquanto só pode ser suficiente para gerar um par de ratos PDX modelos^15,16. Além disso, as larvas de zebrafish em 2-5 DPF já desenvolvem sistemas circulatórios completos e órgãos metabólicos, como fígado e rim, mas não o sistema imunológico¹⁷, enquanto o saco de gema remanescente é um meio natural 3D, ideal para triagem de drogas, drogas testes de resistência e observações de migração tumoral^6,18,19,^20,21.

Com uma tentativa final de usar zPDX como uma plataforma de triagem/teste para uso clínico, aqui, descrevemos uma proposta otimizada para o modelo zPDX de câncer pancreático, que permite a avaliação in vivo do candidato a drogas dentro de um curto espaço de tempo usando menos células a custos mais baixos. Comparado com as referências anteriores sobre zpdx^6,9,10, introduzimos várias otimizações para tornar o sistema mais viável e confiável para o diagnóstico clínico personalizado: 1) pré-classificação de células diferentes grupos nos tecidos primários do tumor e estabilizando as células primárias por uma semana antes de novas experiências; 2) rotular as células humanas e melhorar a viabilidade celular em Xenoenxerto via modificação genética baseada em Lentivirus; 3) otimizando a condição de cultura zebrafish em ambos os suplementos de nutrição (glicose e glutamina) e temperatura; 4) quantificando as respostas medicamentosas de diferentes tipos de células de forma comparativa. Também fizemos alterações na solução de injeção adicionando vários materiais complementares. Ao todo, essas melhorias proporcionam a possibilidade de gerar rapidamente um Xenoenxerto mais paciente-like em hospedeiros zebrafish que podem ser usados como uma ferramenta confiável para avaliar a resposta dos medicamentos candidatos.

Protocol

Todos os procedimentos animais foram aprovados e seguiram as diretrizes do Comitê de ética animal da Universidade de Fudan e todos os espécimes de câncer pancreático foram obtidos do centro de câncer de Xangai da Universidade de Fudan. A aprovação ética foi obtida do Comitê de ética da FUSCC, e o termo de consentimento livre e esclarecido foi obtido por cada paciente. 1. preparando o equipamento para a microinjeção Preparando a placa de injeção. …

Representative Results

Um esboço esquematizado do procedimento é representado na Figura 1. No short, as pilhas preliminares do tecido do cancro foram semeadas no meio completo após a digestão com ou sem a adição de inibidores pancreatic do fibroblasto do cancro. As células cancerosas e os fibroblastos foram enriquecidos como duas populações distintas que os fibroblastos dominaram sem inibidores, e o crescimento das células cancerosas prevaleceu após a adição de inibido…

Discussion

Ambos os modelos PDX e CDX são plataformas vitais no campo da biologia tumoral²², e o passo crítico de um transplante de sucesso entre espécies é melhorar a sobrevida do Xenoenxerto.  Recentemente, alguns estudos mostraram que a expressão transitória de BCL2L1 (BCL-XL) ou BCL2 pode melhorar significativamente a viabilidade de células-tronco embrionárias humanas em hospedeiros de camundongos sem afetar as identidades celulares e destinos²³…

Materials

DMEM	GIBCO	C11995500BT
FBS	Hyclone	sv30087.03
Y-27632	Cliniscience	Y0503	Rho kinase inhibitor
Primocin	invivogen	ant-pm-1	an antibiotic for primary cell cultures
Putrescine dihydrochloride	Sigma	P5780
Nicotinamide	Sigma	N3376
penicillin streptomycin	GIBCO	15140122.00
phosphate buffer (PBS)	GIBCO	C10010500CP
HBSS	GIBCO	14170112.00
collagenase type IV	GIBCO	17104019.00
hyaluronidase	Sigma	H3884
DnaseⅠ	Sigma	D5025
insulin	Sigma	I9278
b-FGF	GIBCO	PHG0264
EGF	GIBCO	PHG0314
pancreatic cancer fibroblasts inhibitor	CHI Scientific	FibrOUT
0.45 μm sterile filter	Millipore	SLHV033RB
concentration column	Millipore	Millipore UFC910008	Concentrate the virus
polybrene	Sigma	H9268
Hyaluronic Acid Sodium Salt	Sigma	H7630
L-glutamine	GIBCO	21051024.00
gemcitabine	Gemzan
methylcellulose	Sigma	M0262
Navitoclax(ABT-263)	Selleck	S1001	Bcl-xL inhibitor
Equipment
Microinjector	NARISHIGE
stereomicroscope	OLYMPUS	MVX10
Confocal Microscope	LEICA	SP8	0.00