Method Article

세포 배양 및 초파리 멜라노가스터에서 산화 아연 나노 입자의 독성 연구

DOI:

10.3791/59510

⸱

September 19th, 2019

 ,  ,  ,  , 
1NUS Environmental Research Institute & Department of Anatomy, National University of Singapore, 2NUS Environmental Research Institute & School of Public Health, National University of Singapore, 3Department of Civil and Environmental Engineering, National University of Singapore, 4Department of Anatomy, National University of Singapore

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 특히 산화 아연 나노입자(ZnO NPs)의 독성학적 프로파일을 평가하기 위한 상세한 프로토콜을 설명하며, 특히 인간 MRC5 폐 섬유아세포에서의 세포 사멸 유형 및 과일 플라이 드로소필라에서의ROS 형성을 설명한다.

Abstract

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산화 아연 나노 입자 (ZnO NPs)는 광범위한 응용 프로그램을 가지고 있지만 ZnO NP 관련 독성에 대한 보고의 수는 최근 몇 년 동안 급속히 증가하고 있습니다. 그러나, ZnO NP 유도 독성에 대 한 기본 메커니즘을 해명 하는 연구는 부족. 우리는 시험관 내 및 생체 내 실험 모델을 모두 사용하여 ZnO NPs의 독성 프로파일을 결정했습니다. ZnO NP-노출된 MRC5 폐 섬유아세포에서 세포 생존력의 현저한 감소가 관찰되었으며, ZnO NPs가 세포 독성 효과를 발휘한다는 것을 보여준다. 유사하게, 흥미롭게도, ZnO NPs에 노출된 장은 과일 플라이 드로소필라에서반응성 산소 종 수준(ROS)의 극적인 증가를 나타냈다. 소비자에 의한 ZnO NP의 증가된 사용에 대한 위험 평가를 수립하기 위해서는 보다 심층적인 연구가 필요합니다.

Introduction

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나노 기술은 의학, 재료 과학 및 생화학을 포함한 모든 과학 분야에서 사용되는 나노 크기의 재료의 응용을 말합니다. 예를 들어, 자외선 산란, 화학 적 감지 및 항균 특성뿐만 아니라 높은 전기 전도성으로 알려진 ZnO NPs는 식품 포장, 화장품, 섬유, 고무, 배터리, 자동차 꼬리 가스 처리용 촉매 및 생물 의학 관련 응용 분야1,2,3.

그러나, ZnO NP 기반 제품의 급성장 응용 프로그램, ZnO NP에 대 한 인간의 노출증가로 이어지는, 인간의 건강에 그들의 잠재적인 불리 한 영향에 대 한 우려를 제기 했다. 시험관 내 세포 내 연구의 숫자는 ZnO NPs 산화 스트레스를 유도할 수 있음을 입증했다, 자가 포식 관련 세포 독성, 염증, 및 유독성4,5,6,7,8 . 특히, ZnO ....

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Protocol

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1. 살아있는/고정된 세포에 대한 형광 활성화 세포 선별(FACS) 분석

  1. 15 분 동안 정지에 초음파 ZnO NPs.
  2. 배양 된 세포의 치료를 위해 1 mg / mL ZnO NP 스톡 솔루션을 사용하여 다양한 농도 (예를 들어, 0, 10, 25, 50,100 및 200 μg / mL)에서 ZnO NP를 준비하십시오.
  3. MRC5 인간 폐 섬유아세포(1 x 105 세포/웰)를 하루 전에 6-웰 배양 판위에, 그리고 8시간, 16시간 및 24시간 동안 ZnO NPs 2 mL(삼중)으로 세포를 치료한다.
  4. 각 시점에서, 5 분 동안 300 x g에서 원심 분리하여 세포를 수집합니다.
  5. 세포 펠릿을 인산완충식염수(PBS)로 두 번 세척합니다.
  6. 0.1 M HEPES/수산화 나트륨 (NaOH), 1.4 M 염화 나트륨 (NaCl), 25 mM 염화 칼슘 (CaCl2)으로구성된 1x 결합 버퍼로 세포를 100 μL 당 1 x 105 세포의 농도로 다시 중단하십시오.
  7. 플루오레세인 이소티오차네이트(FITC) 아넥신 V 얼룩 5 μL과 프로피듐 요오드화물(PI) DNA 얼룩 5 μL을 넣고 어두운 실내 온도(RT; 25....

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Results

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NP-노출된 세포는 세포 염색 시약 키트로 처리되었고, 이어서 유세포측정을 사용하여 세포 선별을 하였다. ZnO NP 처리 된 세포 (하단, 오른쪽 패널)는 대조군 세포 (R5, 하단, 왼쪽 패널)보다 초기 (R3) / 후기 세포 (R6)의 높은 백분율을 나타낸다. 괴사 세포 사멸은 R4(위, 오른쪽 패널)로 표시된다(그림2). ZnO NP 처리 MRC-5 섬유아세포에 대한 FITC/합병 V 분석의 결과는 도 2에나타내고 있다.

Drosophila 실험을 위해, 다양한 농도에서 초음파 처리된 ZnO NPs를 10 mL 튜브에서 플라이 푸드에 첨가한 다음 파이펫 컨트롤러를 사용하여 잘 혼합하였다(그림3).<.......

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Discussion

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ZnO NP가 MRC5 섬유아세포에서 세포사멸을 유도할 수 있는지 평가하기 위해, 우리는 유동 세포분석기를 사용하여 세포를 괴사 세포 또는 세포사멸과 구별합니다. 일반적인 살아있는 세포에서는, 포스파티딜세린 (PS)는 세포막에서 국한됩니다. 세포자멸이 발생하는 경우, PS는 혈장막의 세포외 리플렛으로 옮겨져, 플루오레세인(FITC Annexin V)으로 표지된 아넥신 V의 결합을허용한다(FITCAnnexin V) 29. 한편, 적형프로피듐(PI)은 핵산 결합 염료로, 살아있는 세포및 세포사멸세포에 불투과성이지만 죽은세포(30)를염색한다. 이를 통해 우리는 죽은 세포 (적색 및 녹색), 세포 사멸 세포 (녹색 형광) 및 살아있는 세포 (거의 또는 전혀 형광)를 식별 할 수 있으며, 여기를 위한 아르곤 이온 레이저의 488 nm 라인을 가진 유세포계를 사용합니다.

Drosophila.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 그들이 경쟁 적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 보조금 번호 R706-000-043-490에 의해 지원되었다. 이 연구는 보조금 스폰서의 견해를 나타내지 않습니다.

....

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Materials

Canton-S

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
15% 메틸 4-하이드록시벤조에이트 시그마 알드리치
4% 파라포름알데히드시그마 알드리치P6148
박토 한천BD 생명과학
cncCK6/TM3, SbDr. Kerppola T
옥수수 가루, 포도당, 효모 양조기시그마 Aldrich
CyAn ADP Summit SoftwareDAKOhttps://flow.usc.edu/files/2014/07/BC-Cyan-ADP-User-Guide-2016.pdf
디하이드로에티듐(하이드로에티딘)Thermo Fisher ScientificD11347
FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit IBD biosciences556547
형광 현미경Olympus
GlucolinSupermarket
ImageJ 소프트웨어NIH
MRC5 인간 폐 섬유아세포ATCCCCL-171
슈나이더 s Drosophila 매체Thermo Fisher Scientific21720-024
Vector LaboratoriesH-1200를 사용한 Vectashield 퇴색 방지 장착 매체
; Sod2N308 / CyO< / em>NIG-FLY
산화 아연 나노 입자시그마 알드리치721077참조 시트 2
DAPI Wild-type

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kim, Y. R., et al. Toxicity of 100 nm zinc oxide nanoparticles: a report of 90-day repeated oral administration in Sprague Dawley rats. International Journal of Nanomedicine. 9 Suppl 2, 109-126 (2014).
  2. Xie, Y., He, Y., Irwin, P. L., Jin, T., Shi, X.

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Zinc Oxide NanoparticlesCell ViabilityReactive Oxygen SpeciesFlow CytometryFluorescence MicroscopyConfocal MicroscopyMRC5 Lung FibroblastsDrosophila MelanogasterGut AnalysisAnnexin V Staining

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