Toxizitätsstudie von Zinkoxid-Nanopartikeln in der Zellkultur und bei Drosophila melanogaster
Summary
Wir beschreiben ein detailliertes Protokoll zur Bewertung der toxikologischen Profile von Zinkoxid-Nanopartikeln (ZnO NPs), insbesondere der Art des Zelltodes in menschlichen MRC5-Lungenfibroblasten und der ROS-Bildung in der Fruchtfliege Drosophila.
Abstract
Zinkoxid-Nanopartikel (ZnO NPs) haben eine breite Palette von Anwendungen, aber die Anzahl der Berichte über ZnO NP-assoziierte Toxizität hat in den letzten Jahren rapide zugenommen. Jedoch, Studien, die die zugrunde liegenden Mechanismen für ZnO NP-induzierte Toxizität aufklären, sind spärlich. Wir ermittelten die Toxizitätsprofile von ZnO NPs anhand von In-vitro- und In-vivo-Experimentalmodellen. Bei ZnO NP-exponierten MRC5-Lungenfibroblasten wurde eine signifikante Abnahme der Zelllebensfähigkeit beobachtet, was zeigt, dass ZnO NPs zytotoxische Wirkungen ausüben. In ähnlicher Weise, interessanterweise, Darm ausgesetzt ZnO NPs zeigte einen dramatischen Anstieg der reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in der Fruchtfliege Drosophila. Es sind eingehendere Studien erforderlich, um eine Risikobewertung für die verstärkte Nutzung von ZnO-NPs durch Verbraucher zu erstellen.
Introduction
Nanotechnologie bezieht sich auf die Anwendung nanogroßer Materialien, die in allen wissenschaftlichen Bereichen verwendet werden, einschließlich Medizin, Materialwissenschaft und Biochemie. ZnO NPs, die für ihre ultraviolette Streuung, chemische Sensorik und antimikrobielle Eigenschaften sowie hohe elektrische Leitfähigkeit bekannt sind, werden beispielsweise bei der Herstellung verschiedener Konsumgüter wie Lebensmittelverpackungen, Kosmetika, Textilien, Kautschuke, Batterien, Katalysatoren für die Rückgasbehandlung von Kraftfahrzeugen und biomedizinische Anwendungen1,2,3.
Die aufkeimenden Anwendungen von ZnO NP-basierten Produkten, die zu einer erhöhten Exposition des Menschen gegenüber ZnO-NPs führen, haben jedoch Bedenken hinsichtlich ihrer möglichen nachteiligen Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit aufkommen lassen. Eine Reihe von in vitro zellulären Studien haben gezeigt, dass ZnO NPs oxidativen Stress, autophagiebedingte Zytotoxizität, Entzündung und Genotoxizität4,5,6,7,8 induzieren können . Insbesondere wird angenommen, dass die Toxizität von ZnO NPs durch die Auflösung von Zn zu freien Zn2+-Ionen sowie die Oberflächenreaktivität von ZnO verursacht wird, was zu den zellulären ionischen und metabolischen Ungleichgewichten führt, die mit einer beeinträchtigten ionischen Homöostase und Hemmung des Ionentransports4,7,9,10. Wichtig ist, dass Studien gezeigt haben, dass die Erzeugung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) einer der primären Mechanismen ist, die ZnO NPs-assoziierte Toxizität zugrunde liegen. Unzureichende antioxidative Aktivität nach ROS Beleidigung hat sich als verantwortlich für die Auslösung der Zytotoxizität und DNA-Schäden9. Die toxischen Wirkungen von ZnO NPs wurden auch in Tiermodellen berichtet, einschließlich Nagetier1, Zebrafisch11,12, sowie die wirbellose Drosophila13.
Drosophila dient als etabliertes alternatives Tiermodell für das Toxizitätsscreening chemischer Einheiten und Nanomaterialien (NMs)14,15. Wichtig ist, dass es ein hohes Maß an genetischer und physiologischer Ähnlichkeit zwischen dem Menschen und Drosophila gibt, was die Verwendung von Drosophila als In-vivo-Modell für die Bewertung biologischer Reaktionen auf Umweltschadstoffe wie NMs rechtfertigt. 16. Darüber hinaus gibt es viele Vorteile der Verwendung von Drosophila aufgrund seiner geringen Größe, kurze Lebensdauer, genetische Amenabilität, und einfache und kostengünstige Wartung. Darüber hinaus ist Drosophila weithin für die Erforschung der Genetik, Molekular- und Entwicklungsbiologie angenommen worden, seit sein vollständiges Genom vor Jahren im Jahr 2000 vollständig sequenziert wurde, wodurch es für eine Vielzahl von Hochdurchsatz-Screenings geeignet ist. und zur Behandlung ungelöster biologischer Fragen17,18,19,20,21. In den letzten Jahren, eine Reihe von Studien im Zusammenhang mit Immuntoxizität mit verschiedenen Arten von NPs in Drosophila wurden berichtet15,22,23,24. Dieses grundlegende neue Wissen aus den Studien mit Drosophila hat dazu beigetragen, mehr Einblicke in unser Verständnis der Nanotoxikologie zu geben.
ROS ist ein bekannter Schuldiger für Zytotoxizität und Genotoxizität, verursacht durch NPs, insbesondere metallbasierte NPs25. ROS sind sauerstoffhaltige chemische Spezies mit höheren reaktiven Eigenschaften als molekularer Sauerstoff. Freie Radikale wie Superoxid-Radikal (O2–) und sogar nicht-radikale Moleküle wie Wasserstoffperoxid (H2O2) können als ROS fungieren. Unter normalen physiologischen Bedingungen sind sie verpflichtet, zelluläre Homöostase26zu erhalten, jedoch kann übermäßige ROS aufgrund von Überproduktion oder Dysregulation des antioxidativen Abwehrsystems oxidativen Stress verursachen, was zu Schäden an Proteinen führen, Lipide und Desoxyribonukleinsäure (DNA)27. Zum Beispiel, wenn ROS-Spiegel erhöhen und Glutathion (GSH) Niveau sinkt gleichzeitig, Störung der Adenosintriphosphat (ATP) Synthese findet statt und Lactat-Dehydrogenase (LDH) Niveau steigt im Medium, gipfelnd in Zelltod27.
Hier bieten wir Protokolle für die Durchführung zellulärer und genetischer Analysen mit kultivierten Säugetierzellen und Drosophila, um die potenziellen Nebenwirkungen von ZnO NPs zu bestimmen. Abbildung 1zeigt eine Übersicht über die Methode zur Toxizitätsstudie von ZnO NPs .
Protocol
Representative Results
Discussion
Um zu beurteilen, ob ZnO NP Apoptose in MRC5-Fibroblasten induzieren kann, verwenden wir Die durchflusszytometrie, um die Zellen vom nekrotischen oder apoptotischen Zelltod zu unterscheiden. In normalen lebenden Zellen wird Phosphatidylserin (PS) an der Zellmembran lokalisiert. Wenn Apoptose auftritt, wird PS in die extrazelluläre Packungsbeilage der Plasmamembran transziert, so dass die Bindung von Annexin V mit Fluorescein (FITC Annexin V)29gekennzeichnet ist. Andererseits ist das rotfluoreszie…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Studie wurde durch die Stipendiennummer R706-000-043-490 unterstützt. Die Studie stellt nicht die Ansicht des Stipendiaten dar.
Materials
| 15% Methyl 4-Hydroxybenzoate | Sigma Aldrich | ||
| 4% Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Bacto Agar | BD biosciences | ||
| cncCK6/TM3, Sb | a gift from Dr. Kerppola T | ||
| cornmeal, glucose, yeast brewer | Sigma Aldrich | ||
| CyAn ADP with Summit Software | DAKO | https://flow.usc.edu/files/2014/07/BC-Cyan-ADP-User-Guide-2016.pdf | |
| Dihydroethidium (Hydroethidine) | Thermo Fisher Scientific | D11347 | |
| FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD biosciences | 556547 | |
| Fluorescent microscope | Olympus | ||
| Glucolin | Supermarket | ||
| Image J software | NIH | ||
| MRC5 human lung fibroblast | ATCC | CCL-171 | |
| Schneider’s Drosophila medium | Thermo Fisher Scientific | 21720-024 | |
| vectashield antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| wild- type Canton-S; Sod2N308/CyO | NIG-FLY | ||
| Zinc Oxide Nanoparticles | Sigma Aldrich | 721077 | Refer Sheet 2 |
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