Étude de toxicité des nanoparticules d'oxyde de zinc dans la culture cellulaire et dans le mélanogaster de Drosophila
Summary
Nous décrivons un protocole détaillé pour évaluer les profils toxicologiques des nanoparticules d’oxyde de zinc (ZnO NPs) en particulier, le type de mort cellulaire dans les fibroblastes pulmonaires HUMAINS MRC5 et la formation de ROS dans la mouche des fruits Drosophila.
Abstract
Les nanoparticules d’oxyde de zinc (ZnO NPs) ont un large éventail d’applications, mais le nombre de rapports sur la toxicité associée à ZnO NP a augmenté rapidement ces dernières années. Cependant, les études qui élucident les mécanismes sous-jacents pour la toxicité NP-induite par ZnO sont maigres. Nous avons déterminé les profils de toxicité des nP znO utilisant des modèles expérimentaux in vitro et in vivo. Une diminution significative de la viabilité cellulaire a été observée dans les fibroblastes pulmonaires MRC5 exposés au nP De ZnO, ce qui montre que les NP ZnO exercent des effets cytotoxiques. De même, il est intéressant de noter que l’intestin exposé aux nCp ZnO a montré une augmentation spectaculaire des niveaux d’espèces réactives d’oxygène (ROS) dans la mouche des fruits Drosophila. Des études plus approfondies sont nécessaires pour établir une évaluation des risques pour l’utilisation accrue des nP ZnO par les consommateurs.
Introduction
La nanotechnologie fait référence à l’application de matériaux nanométriques qui sont utilisés dans tous les domaines scientifiques, y compris la médecine, la science des matériaux et la biochimie. Par exemple, les NP ZnO qui sont connus pour leur diffusion ultraviolette, leur détection chimique et leurs propriétés antimicrobiennes, ainsi que pour leur conductivité électrique élevée, sont utilisés dans la production de divers produits de consommation tels que les emballages alimentaires, les cosmétiques, textiles, caoutchoucs, batteries, catalyseur pour le traitement du gaz de queue automobile, et applications biomédicales1,2,3.
Cependant, les applications naissantes des produits à base de NP ZnO, conduisant à une exposition accrue de l’homme aux nP ZnO, ont soulevé des préoccupations sur leurs effets néfastes potentiels sur la santé humaine. Un certain nombre d’études cellulaires in vitro ont démontré que les NP de ZnO peuvent induire le stress oxydatif, la cytotoxicité autophagie-connexe, l’inflammation, et la génotoxicité4,5,6,7,8 . Notamment, la toxicité des NP ZnO est supposée être causée par la dissolution de Zn pour libérer les ions Zn2, ainsi que la réactivité de surface de ZnO, résultant en déséquilibres ioniques et métaboliques cellulaires qui sont liés à l’homéostasie ionique altérée et un inhibition du transport ionique4,7,9,10. Fait important, des études ont montré que la génération d’espèces réactives d’oxygène (ROS) est l’un des mécanismes primaires sous-jacents à la toxicité associée à ZnO NPs. L’activité anti-oxydante insuffisante suivant l’insulte de ROS s’est avérée responsable de l’obtention de la cytotoxicité et des dommages d’ADN9. Les effets toxiques des NP ZnO ont également été signalés chez les modèles animaux, y compris le rongeur1, poisson zèbre11,12, ainsi que l’invertébré Drosophila13.
Drosophila sert de modèle animal alternatif bien établi pour le dépistage de la toxicité des entités chimiques et des nanomatériaux (NM)14,15. Fait important, il existe des niveaux élevés de similitude génétique et physiologique entre l’homme et la drosophile qui justifie l’utilisation de la drosophile comme modèle in vivo pour évaluer les réponses biologiques aux contaminants environnementaux tels que les NM 16. En outre, il y a beaucoup d’avantages d’utiliser Drosophila en raison de sa petite taille, de sa courte durée de vie, de son aptitude génétique et de son entretien facile et rentable. En outre, Drosophila a été largement adopté pour l’étude de la génétique, la biologie moléculaire et développementale, depuis que son génome complet a été entièrement séquencé il ya des années en 2000, ce qui le rend approprié pour une variété de dépistage à haut débit et pour s’attaquer aux questions biologiques non résolues17,18,19,20,21. Ces dernières années, un certain nombre d’études liées à l’immunotoxicité utilisant différents types de NP dans Drosophila ont été rapportés15,22,23,24. Ces nouvelles connaissances fondamentales obtenues à partir des études utilisant Drosophila ont contribué à fournir plus de perspicacité dans notre compréhension de la nanotoxicologie.
ROS est un coupable bien connu pour la cytotoxicité et la génotoxicité causées par les nP, en particulier, à base de métal NPs25. Les ROS sont des espèces chimiques contenant de l’oxygène avec des propriétés réactives plus élevées que l’oxygène moléculaire. Les radicaux libres tels que le radical superoxyde (O2–) et même, les molécules non radicales telles que le peroxyde d’hydrogène (H2O2) peuvent agir comme ROS. Dans l’état physiologique normal, ils sont tenus de maintenir l’homéostasie cellulaire26, cependant, ROS excessive en raison de la surproduction ou la dysrégulation du système de défense antioxydant peut causer un stress oxydatif, conduisant à des dommages aux protéines, lipides et acide désoxyribonucléique (ADN)27. Par exemple, à mesure que les niveaux de ROS augmentent et que le niveau de glutathion (GSH) diminue de façon concomitante, la perturbation de la synthèse de l’adénosine triphosphate (ATP) a lieu et le niveau de déshydrogénase de lactate (LDH) augmente dans le milieu, aboutissant à la mort cellulaire27.
Ici, nous fournissons des protocoles pour effectuer des analyses cellulaires et génétiques utilisant les cellules cultivées de mammifères et Drosophila pour déterminer les effets défavorables potentiels des NPs de ZnO. Un aperçu de la méthode utilisée pour l’étude de toxicité des nP ZnO est montré dans la figure 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Afin d’évaluer si ZnO NP peut induire l’apoptose dans les fibroblastes DE MRC5, nous utilisons la cytométrie de flux pour distinguer les cellules de la mort nécrotique ou apoptotique de cellules. Dans les cellules vivantes normales, la phosphatidylserine (PS) est localisée à la membrane cellulaire. En cas d’apoptose, PS est translogué dans le dépliant extracellulaire de la membrane plasmatique, permettant la liaison de l’annexe V étiquetée avec de la fluorescéine (FITC Annexin V)29. D’au…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L’étude a été appuyée par le numéro de subvention R706-000-043-490. L’étude ne représente pas le point de vue du promoteur de la subvention.
Materials
| 15% Methyl 4-Hydroxybenzoate | Sigma Aldrich | ||
| 4% Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Bacto Agar | BD biosciences | ||
| cncCK6/TM3, Sb | a gift from Dr. Kerppola T | ||
| cornmeal, glucose, yeast brewer | Sigma Aldrich | ||
| CyAn ADP with Summit Software | DAKO | https://flow.usc.edu/files/2014/07/BC-Cyan-ADP-User-Guide-2016.pdf | |
| Dihydroethidium (Hydroethidine) | Thermo Fisher Scientific | D11347 | |
| FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD biosciences | 556547 | |
| Fluorescent microscope | Olympus | ||
| Glucolin | Supermarket | ||
| Image J software | NIH | ||
| MRC5 human lung fibroblast | ATCC | CCL-171 | |
| Schneider’s Drosophila medium | Thermo Fisher Scientific | 21720-024 | |
| vectashield antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| wild- type Canton-S; Sod2N308/CyO | NIG-FLY | ||
| Zinc Oxide Nanoparticles | Sigma Aldrich | 721077 | Refer Sheet 2 |
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