एक फ्लोटिंग हाइड्रोपोनिक सिस्टम में Arabidopsis thaliana जड़ें पर बैक्टीरियल उपनिवेशन और रखरखाव की निगरानी
Summary
यहाँ हम प्रजातियों की उपस्थिति की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक hydroponic संयंत्र विकास परख का वर्णन और संयंत्र जड़ों के प्रारंभिक उपनिवेशन के दौरान बैक्टीरिया के स्थानिक वितरण कल्पना और विभिन्न विकास के वातावरण में उनके हस्तांतरण के बाद.
Abstract
जीवाणु रोगाणुओं, बड़े जीवों और अजैविक वातावरण के बीच बातचीत करके जटिल राइज़ोस्फीयर माइक्रोबायोम बनाते हैं। प्रयोगशाला शर्तों के तहत, पौधों के विकास को बढ़ावा देने वाले बैक्टीरिया (पीजीपीबी) द्वारा राइज़ोस्फीयर उपनिवेशन बिना उपनिवेशित पौधों के सापेक्ष स्वास्थ्य या मेजबान पौधों के विकास को बढ़ा सकता है। हालांकि, क्षेत्र सेटिंग्स में, PGPB के साथ जीवाणु उपचार अक्सर फसलों के लिए पर्याप्त लाभ प्रदान नहीं करते हैं। एक स्पष्टीकरण यह है कि यह पौधे की उम्र से अधिक अंतर्जात मिट्टी रोगाणुओं के साथ बातचीत के दौरान पीजीपीबी के नुकसान के कारण हो सकता है। इस संभावना की पुष्टि करने के लिए मुश्किल हो गया है, के बाद से ज्यादातर अध्ययन ों के बजाय rhizosphere समुदायों के भीतर PGPB के रखरखाव के प्रारंभिक उपनिवेशपर ध्यान केंद्रित. यह यहाँ hypothesized है कि विधानसभा, सह-अस्तित्व, और जीवाणु समुदायों के रखरखाव rhizosphere microenvironment के नियतात्मक सुविधाओं के आकार के हैं, और है कि इन बातचीत देशी सेटिंग्स में PGPB अस्तित्व को प्रभावित कर सकते हैं. इन व्यवहारों का अध्ययन करने के लिए, एक हाइड्रोपोनिक संयंत्र-वृद्धि परख को पौधों की जड़ों के प्रारंभिक उपनिवेशन के दौरान बैक्टीरिया के स्थानिक वितरण की मात्रा निर्धारित करने और कल्पना करने के लिए Arabidopsis thaliana का उपयोग करके अनुकूलित किया जाता है और विभिन्न विकास के लिए स्थानांतरण के बाद वातावरण. इस प्रणाली की पुन: उत्पादनीयता और उपयोगिता तो अच्छी तरह से अध्ययन PGPB Peudomonas simiaeके साथ मान्य कर रहे हैं. जांच करने के लिए कैसे कई जीवाणु प्रजातियों की उपस्थिति संयंत्र की जड़ पर उपनिवेशन और रखरखाव गतिशीलता को प्रभावित कर सकते हैं, तीन जीवाणु उपभेदों से एक मॉडल समुदाय (एक Arthrobacter, Curtobacterium, और माइक्रोबैक्टीरियम प्रजातियों) मूल रूप से ए thaliana rhizosphere से अलग का निर्माण किया है. यह दिखाया गया है कि इन विविध जीवाणु प्रजातियों की उपस्थिति इस hydroponic संयंत्र-maintanence परख, जो अनुक्रमण आधारित जीवाणु समुदाय के अध्ययन के लिए एक विकल्प प्रदान करता है का उपयोग कर मापा जा सकता है. इस प्रणाली का उपयोग कर भविष्य के अध्ययन समय के साथ और बदलते पर्यावरण की स्थिति में multispecies संयंत्र microbiomes में जीवाणु व्यवहार की समझ में सुधार हो सकता है.
Introduction
जीवाणु और फंगल रोगों के कारण फसल नष्ट होने से खाद्य उत्पादन कम होता है और यह वैश्विक स्थिरता को बुरी तरह से बाधित कर सकताहै. खोज के आधार पर कि दमनकारी मिट्टी में रोगाणुओं संयंत्र स्वास्थ्य2बढ़ाने के लिए जिम्मेदार हैं , वैज्ञानिकों ने पूछा है कि क्या संयंत्र microbiome की उपस्थिति और विशेष की बहुतायत को संशोधित करके संयंत्र के विकास का समर्थन करने के लिए leveraged किया जा सकता है जीवाणु प्रजातियों3| पौधों के विकास या विकास में सहायता करने के लिए पाए जाने वाले बैक्टीरिया को सामूहिक रूप से पौधों के विकास को बढ़ावा देने वाले बैक्टीरिया (पीजीपीबी) कहा जाता है। हाल ही में, अध्ययन बस संभावित PGPB की पहचान करने से स्थानांतरित कर दिया है समझने के लिए कैसे मिट्टी में interkingdom बातचीत, जड़ों के आसपास, या rhizosphere में (क्षेत्र सीधे आसपास और जड़ की सतह सहित) PGPB प्रभावित हो सकता है गतिविधि4|
पीजीपीबी द्वारा राइजोस्फीज उपनिवेशन से बिना उपनिवेशित पौधों के सापेक्ष विभिन्न तनावों के जवाब में मेजबान पौधों के स्वास्थ्य या विकास में वृद्धि हो सकतीहै 5. तथापि, निकट नियंत्रित ग्रीनहाउस और प्रयोगशाला सेटिंग्स6में देखे गए परिणामों की तुलना में देशी मिट्टी की स्थितियों में परिणाम प्रायः अधिक परिवर्तनशील होते हैं। इस अंतर के लिए एक परिकल्पना यह है कि पीजीपीबी के विकास या व्यवहार को खेतों में देशी मिट्टी के बैक्टीरिया या कवक द्वारा बाधित किया जा सकता है7,8. rhizosphere बैक्टीरिया द्वारा लाभकारी प्रभाव आम तौर पर बैक्टीरिया की क्षमता पर निर्भर करने के लिए 1) का पता लगाने और जड़ की ओर ले जाने के लिए, 2) biofilm गठन के माध्यम से जड़ उपनिवेश, और 3) मेजबान संयंत्र या रोगजनकों के साथ बातचीत छोटे अणु के उत्पादन के माध्यम से चयापचय7,9. इनमें से कोई भी उपनिवेशन व्यवहार पड़ोसी सूक्ष्मजीवों की उपस्थिति और गतिविधि से प्रभावित हो सकताहै.
हमने राइज़ोस्फीयर के इन विशिष्ट जीवाणु उपनिवेशन चरणों की मात्रा निर्धारित करने और कल्पना करने के लिए एक प्रणाली तैयार की है (चित्र 1)। इस दृष्टिकोण से अध्ययन की सुविधा होगी कि क्यों लंबे समय तक पीजीपीबी रखरखाव कभी-कभी पौधों को नए वातावरण में स्थानांतरित करने के बाद नहीं देखा जाता है, जैसे कि पूर्व-संपीड़ित पौध रोपण के दौरान। प्रयोगशाला अध्ययनों में इसके व्यापक उपयोग के साथ -साथ इसके माइक्रोबियल इंटरैक्शन11के बारे में उपलब्ध पर्याप्त डेटा के कारण अरबिडोप्सिस थालियाना को संयंत्र मॉडल के रूप में चुना गया . प्रणाली में तीन चरण हैं: 1) ए थालियाना वृद्धि, 2) जीवाणु उपनिवेशन, और 3) जीवाणु रखरखाव (चित्र 1देखें)। क्योंकि ए thaliana एक स्थलीय संयंत्र है, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण था कि यह hydroponic प्रणाली12में अनुचित पानी के तनाव पीड़ित नहीं था. हैनी एट अल 13 द्वाराइस्तेमाल किया तरीकों से प्रेरित होकर, अंकुर तरल विकास माध्यम से गोली मार अलग करने के लिए प्लास्टिक जाल पर बड़े हो रहे हैं। इस प्रणाली के स्वास्थ्य और संयंत्र मेजबान के विकास से समझौता करने के लिए प्रकट नहीं होता है, और यह तरल11में ए thaliana विकास में सुधार. के रूप में संयंत्र गोली मार सतह के ऊपर तैरता है, जड़ों को पूरी तरह से तरल जीवाणु विकास माध्यम में inoculated बैक्टीरिया द्वारा उपनिवेशन के संपर्क में हैं. यह ब्याज के बैक्टीरिया पोषक तत्वों है कि विकास के लिए सबसे अधिक अनुकूल हैं में उपनिवेशन के लिए जांच की अनुमति देता है, जबकि फिर शर्तों स्थानांतरण संयंत्र एक पोषक तत्व अपने विकास का समर्थन करने के लिए डिज़ाइन में बढ़ रही जारी रखने के लिए अनुमति देने के लिए. दोनों अवस्थाओं में जड़13के एनॉक्सिया को रोकने के लिए लगातार झटकों का समावेश है . बैक्टीरिया कल्पना या या तो उपनिवेशन माध्यम या रखरखाव माध्यम से हस्तांतरण के बाद संयंत्र की जड़ों से मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. इस hydroponic प्रणाली बहुत लचीला है, प्रयोगात्मक स्थितियों की अनुमति और लागू तनाव आसानी से शोधकर्ताओं के हितों के आधार पर बदला जा करने के लिए.
यह वर्णित विधि संयंत्र microbe बातचीत के बारे में साहित्य के बड़े शरीर के संदर्भ में महत्वपूर्ण है क्योंकि यह जड़ की सतह पर इन बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक मजबूत प्रणाली प्रदान करता है, जबकि भी की वृद्धि वरीयताओं के लिए अनुकूलन किया जा रहा विभिन्न बैक्टीरिया. संयंत्र जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं अक्सर ठोस agar पर संयंत्र microbe उपनिवेशन प्रयोगों प्रदर्शन, केवल planar आंदोलन के लिए अनुमति देता है (यदि है कि) बैक्टीरिया की, जबकि भी बाद में हस्तांतरण के दौरान पौधों की संभावित विनाशकारी हेरफेर की आवश्यकता होती है. इसके विपरीत, सूक्ष्म जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं ने अपने प्रयोगों के भीतर बैक्टीरिया केस्वास्थ्य को अक्सर प्राथमिकता दी है , पौधों की नुकसान14,15. संयंत्र और सूक्ष्म जीव विज्ञान केंद्रित प्रयोगशालाओं की इन विभिन्न प्राथमिकताओं ने ऐतिहासिक रूप से इन समूहोंके बीच परिणामों की तुलना करना कठिन बना दिया है, क्योंकि प्रत्येक आम तौर पर अपने जीव को ब्याज के 15 का अनुकूलन करने के लिए प्रयोगात्मक स्थितियों का अनुकूलन करता है। यहाँ वर्णित फ्लोटिंग-मेश-प्लांट-ग्रोथ सिस्टम पूर्ण संयंत्र जलमग्न को रोकता है, जो पिछले माइक्रोबायोलॉजी उन्मुख अध्ययनों के लिए एक उल्लेखनीय लाभ है, जबकि उपनिवेशन की सुविधा के लिए बैक्टीरिया के विकास और अस्तित्व को अस्थायी रूप से अनुकूलित करता है। इस प्रकार, परख हम यहाँ मौजूद दोनों संयंत्र जीवविज्ञानियों से चिंताओं को संबोधित कर सकते हैं (के बारे में अधिक निर्जलीकरण और संयंत्र के स्पर्श हेरफेर) जबकि microbiologists के मानदंडों को संतुष्ट (विभिन्न जीवाणु विकास की स्थिति और कई के लिए अनुमति देता है प्रजाति’ बातचीत)7| इस प्रोटोकॉल के लिए विभिन्न बैक्टीरिया, पौधों, और पर्यावरण की स्थिति के साथ उपयोग के लिए अनुकूलनीय बनाया गया है.
Protocol
Representative Results
Discussion
सभी वातावरण में पौधे हजारों लोगों के साथ विभिन्न बैक्टीरिया और कवक5,7 के साथ जुड़तेहैं. ये बातचीत या तो नकारात्मक और सकारात्मक फसल उपज और खाद्य उत्पादन पर संभावित प्रभाव के साथ, सं?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम ऊर्जा जैविक और पर्यावरण अनुसंधान विभाग (DOE-BER 0000217519 से ई.ए.एस.), राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (ईएएस के लिए आईएसईआरआईईआरआईओएस-1343020) द्वारा प्रदान किए गए अनुसंधान निधियों द्वारा समर्थित किया गया था। SLH भी राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन स्नातक अनुसंधान फैलोशिप कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था. हम जीवाणु उपभेदों और अमूल्य अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए डॉ जेफरी डांगल धन्यवाद। हम प्रयोगात्मक सुझावों के लिए डॉ एंड्रयू क्लेन और मैथ्यू जे शक्तियों धन्यवाद. अंत में, SLH हमें याद दिलाना है कि विज्ञान के प्रसार एक विशेषाधिकार और एक जिम्मेदारी है, विशेष रूप से रचनात्मक और सुलभ साधन के माध्यम से सामाजिक मीडिया पर कनेक्शन धन्यवाद करना चाहते हैं.
Materials
| Required Materials | |||
| 1.5 mL eppendorf tubes | any | N/A | |
| 24-well plates | BD Falcon | 1801343 | |
| Aeraseal | Excel Scientific | BE255A2 | |
| Autoclave | any | N/A | |
| Bacteria of Interest | any | N/A | Stored at -80˚C in 40% glycerol preferred |
| BactoAgar | BD | 2306428; REF 214010 | |
| bleach | any | N/A | |
| Conviron | any | N/A | Short Day Light-Dark Cycles: 460-600 µmoles/m²/s set at 9/15 hours light/dark at 18/21˚C, with inner power outlet |
| Dessicator Jar: glass or heavy plastic | any | N/A | |
| Ethanol | any | N/A | |
| Flame | any | N/A | |
| Forceps | any | N/A | |
| Incubator | any | N/A | At optimal temperature for growth of specified bacteria |
| Hydrochloric Acid | any | N/A | |
| Lennox LB Broth | RPI | L24066-1000.0 | |
| Microcentrifuge | any | N/A | |
| Micropipetters | any | N/A | Volumes 5 µL to 1000 µL |
| Microscope (preferably fluorescence) | any | N/A | Could be light if best definition not important |
| MS Salts + MES | RPI | M70300-50.0 | |
| Orbital Plate Shaker | any | N/A | Capable of running at 220 rpm for at least 96 hours |
| Petri Dishes | any | N/A | 50 mL total volume |
| Reservoirs | any | N/A | |
| Spectrophotometer | any | N/A | |
| Standard Hole Punch | any | N/A | Approximately 7mm punch diameter |
| Sterile water | any | N/A | |
| Surgical Tape | 3M | MMM1538-1 | |
| Teflon Mesh | McMaster-Carr | 1100t41 | |
| Ultrasonicator | any | N/A | |
| Vortex Mixer | any | N/A | |
| X-gal | GoldBio | x4281c | other vendors available |
| Suggested Materials | |||
| 24 Prong Ultrasonicator attachment | any | N/A | For sonicating multiple samples at once. Can be done individually |
| Alumaseal II | Excel Scientific | FE124F | |
| Glass beads | any | N/A | |
| Multipetter/Repetter | any | N/A | |
| Sterile 96-well plates | any | N/A | For serial dilutions. Can be replaced by eppendorf tubes |
| Biological Materials Used | |||
| Arabidopsis thaliana seeds | any | N/A | We recommend Arabidopsis Biological Resource Center for seed stocks |
| Arthrobacter nicotinovorans | Levy, et al. 2018 | ||
| Curtobacterium oceanosedimentum | Levy, et al. 2018 | ||
| Microbacterium oleivorans | Levy, et al. 2018 | ||
| Pseudomonas simiae WCS417r | Published in a similar system in Haney, et al. 2015. Strain used developed in Cole, et al. 2017 |
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