Surveillance de la colonisation bactérienne et de l'entretien des racines d'Arabidopsis thaliana dans un système hydroponique flottant
Summary
Ici, nous décrivons un analyse de croissance des plantes hydroponiques pour quantifier la présence des espèces et visualiser la répartition spatiale des bactéries lors de la colonisation initiale des racines des plantes et après leur transfert dans différents environnements de croissance.
Abstract
Les bactéries forment des microbiomes rhizosphèrecomplexes façonnés par des microbes en interaction, des organismes plus gros et l’environnement abiotique. Dans des conditions de laboratoire, la colonisation de la rhizosphère par des bactéries favorisant la croissance des plantes (PGPB) peut augmenter la santé ou le développement de plantes hôtes par rapport aux plantes non colonisées. Cependant, dans les milieux de terrain, les traitements bactériens avec PGPB souvent ne fournissent pas d’avantages substantiels aux cultures. Une explication est que cela peut être dû à la perte de la PGPB lors d’interactions avec les microbes du sol endogène au cours de la durée de vie de la plante. Cette possibilité a été difficile à confirmer, puisque la plupart des études se concentrent sur la colonisation initiale plutôt que sur le maintien du PGPB dans les communautés de rhizosphère. On suppose ici que l’assemblage, la coexistence et le maintien des communautés bactériennes sont façonnés par les caractéristiques déterministes du microenvironnement de la rhizosphère, et que ces interactions peuvent avoir un impact sur la survie du PGPB dans les milieux indigènes. Pour étudier ces comportements, un analyse hydroponique de croissance des plantes est optimisée en utilisant Arabidopsis thaliana pour quantifier et visualiser la distribution spatiale des bactéries lors de la colonisation initiale des racines des plantes et après le transfert vers une croissance différente Environnements. La reproductibilité et l’utilité de ce système sont ensuite validées avec le PGPB Pseudomonas simiaebien étudié. Étudier comment la présence de plusieurs espèces bactériennes peut affecter la dynamique de colonisation et d’entretien sur la racine de la plante, une communauté modèle de trois souches bactériennes (un Arthrobacter, Curtobacterium, et Microbacterium espèces) à l’origine isolée de la rhizosphère A. thaliana est construite. Il est démontré que la présence de ces diverses espèces bactériennes peut être mesurée à l’aide de cet analyse hydroponique de la mainntuence des plantes, qui offre une alternative aux études communautaires bactériennes basées sur le séquençage. De futures études utilisant ce système pourraient améliorer la compréhension du comportement bactérien dans les microbiomes végétaux multispécifiques au fil du temps et dans les conditions environnementales changeantes.
Introduction
La destruction des cultures par les maladies bactériennes et fongiques entraîne une baisse de la production alimentaire et peut gravement perturber la stabilité mondiale1. Sur la base de la découverte que les microbes dans les sols suppressifs sont responsables de l’augmentation de la santé des plantes2, les scientifiques ont demandé si le microbiome végétal peut être exploité pour soutenir la croissance des plantes en modifiant la présence et l’abondance de particulier espèces bactériennes3. Les bactéries qui aident à la croissance ou au développement des plantes sont collectivement appelées bactéries favorisant la croissance des plantes (PGPB). Plus récemment, des études sont passées de la simple identification du PGPB potentiel à la compréhension de la façon dont les interactions inter-royaumes dans le sol, autour des racines ou dans la rhizosphère (la zone qui entoure directement et y compris la surface racinaire) peuvent avoir un impact sur le PGPB. activité4.
La colonisation de la rhizosphère par pgPB peut augmenter la santé ou le développement des plantes hôtes en réponse à divers facteurs de stress par rapport aux plantes non colonisées5. Cependant, les résultats sont souvent plus variables dans les conditions du sol indigène par rapport à ceux observés dans les serres et laboratoires étroitement contrôlés6. Une hypothèse pour cette différence est que la croissance ou le comportement de PGPB peut être inhibé par les bactéries indigènes du sol ou des champignons dans les champs7,8. Les effets bénéfiques des bactéries de la rhizosphère dépendent généralement de la capacité des bactéries à localiser et à se déplacer vers la racine, 2) coloniser la racine par la formation de biofilms, et 3) interagir avec la plante hôte ou des agents pathogènes par la production de petites molécules métabolites7,9. N’importe lequel de ces comportements de colonisation peut être affecté par la présence et l’activité des microbes voisins10.
Nous avons conçu un système pour quantifier et visualiser ces stades distincts de colonisation bactérienne de la rhizosphère (Figure 1). Cette approche facilitera les études sur les raisons pour lesquelles l’entretien à long terme du PGPB n’est pas parfois observé après le transfert des plantes dans de nouveaux environnements, comme lors de la plantation de semis pré-inoculés. Arabidopsis thaliana comme ont été choisis comme un modèle végétal en raison de son utilisation intensive dans les études de laboratoire ainsi que les nombreuses données disponibles sur ses interactions microbiennes11. Il y a trois étapes dans le système : 1) a. thaliana croissance, 2) la colonisation bactérienne, et 3) l’entretien bactérien (voir la figure 1). Parce que A. thaliana est une plante terrestre, il était important de s’assurer qu’il ne souffrait pas de stress hydrique indu dans le système hydroponique12. Inspirés par les méthodes utilisées par Haney et coll.13, les semis sont cultivés sur des mailles en plastique pour séparer la pousse du milieu de croissance liquide. Ce système ne semble pas compromettre la santé et le développement de l’hôte de la plante, et il améliore la croissance de A. thaliana dans le liquide11. Lorsque la pousse de la plante flotte au-dessus de la surface, les racines sont pleinement exposées à la colonisation par des bactéries inoculées dans le milieu de croissance bactérienne liquide. Cela permet d’examiner les bactéries d’intérêt pour la colonisation des nutriments qui sont les plus propices à la croissance, tout en changeant les conditions pour permettre à la plante de continuer à croître dans un milieu nutritif conçu pour soutenir sa croissance. Les deux étapes comprennent des secousses régulières pour prévenir l’anoxie de la racine13. Les bactéries peuvent être visualisées ou quantifiées à partir des racines des plantes après le transfert du milieu de colonisation ou du milieu d’entretien. Ce système hydroponique est très flexible, permettant aux conditions expérimentales et aux contraintes appliquées d’être facilement modifiées en fonction des intérêts des chercheurs.
Cette méthode décrite est importante dans le contexte de l’ensemble de la littérature sur les interactions plantes-microbe, car elle fournit un système robuste pour étudier ces interactions à la surface des racines tout en étant personnalisable aux préférences de croissance de bactéries différentes. Les laboratoires de biologie végétale effectuent souvent des expériences de colonisation des microbes végétaux sur l’agar solide, ne permettant que le mouvement planaire (si cela) des bactéries tout en exigeant la manipulation potentiellement destructrice des plantes lors du transfert ultérieur. En revanche, les laboratoires de microbiologie ont souvent donné la priorité à la santé des bactéries dans leurs expériences, au détriment des plantes14,15. Ces différentes priorités des laboratoires axés sur les plantes et la microbiologie ont historiquement rendu difficile la comparaison des résultats entre ces groupes, puisque chacun optimise généralement les conditions expérimentales pour optimiser leur organisme d’intérêt15. Le système flottant-mesh-plant-croissance décrit ici empêche la submersion complète de plante, un avantage notable aux études microbiologiques précédentes, tout en optimisant temporairement la croissance et la survie des bactéries pour faciliter la colonisation. Ainsi, l’analyse que nous présentons ici peut répondre aux préoccupations des biologistes des plantes (sur la surhydratation et la manipulation tactile de la plante) tout en répondant aux critères des microbiologistes (permettant différentes conditions de croissance bactérienne et de multiples interactions des espèces)7. Ce protocole est conçu pour être adaptable pour une utilisation avec diverses bactéries, plantes et conditions environnementales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les plantes dans tous les environnements interagissent avec des milliers à des millions de bactéries et de champignons différents5,7. Ces interactions peuvent avoir un impact négatif et positif sur la santé des plantes, avec des effets potentiels sur le rendement des cultures et la production alimentaire. Des travaux récents suggèrent également que la colonisation variable des cultures par les PGPB peut expliquer la taille imprévisible des plantes et le …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été appuyés par des fonds de recherche fournis par le Département de la recherche biologique et environnementale de l’énergie (DOE-BER 0000217519 à E.A.S.), la National Science Foundation (INSPIRE IOS-1343020 à E.A.S). SLH a également reçu l’appui du Programme de bourses d’études supérieures de la National Science Foundation. Nous remercions le Dr Jeffery Dangl d’avoir fourni des souches bactériennes et des renseignements inestimables. Nous remercions le Dr Andrew Klein et Matthew J. Powers pour leurs suggestions expérimentales. Enfin, SLH tient à remercier les réseaux sociaux de nous rappeler que la diffusion de la science est un privilège et une responsabilité, notamment par des moyens créatifs et accessibles.
Materials
| Required Materials | |||
| 1.5 mL eppendorf tubes | any | N/A | |
| 24-well plates | BD Falcon | 1801343 | |
| Aeraseal | Excel Scientific | BE255A2 | |
| Autoclave | any | N/A | |
| Bacteria of Interest | any | N/A | Stored at -80˚C in 40% glycerol preferred |
| BactoAgar | BD | 2306428; REF 214010 | |
| bleach | any | N/A | |
| Conviron | any | N/A | Short Day Light-Dark Cycles: 460-600 µmoles/m²/s set at 9/15 hours light/dark at 18/21˚C, with inner power outlet |
| Dessicator Jar: glass or heavy plastic | any | N/A | |
| Ethanol | any | N/A | |
| Flame | any | N/A | |
| Forceps | any | N/A | |
| Incubator | any | N/A | At optimal temperature for growth of specified bacteria |
| Hydrochloric Acid | any | N/A | |
| Lennox LB Broth | RPI | L24066-1000.0 | |
| Microcentrifuge | any | N/A | |
| Micropipetters | any | N/A | Volumes 5 µL to 1000 µL |
| Microscope (preferably fluorescence) | any | N/A | Could be light if best definition not important |
| MS Salts + MES | RPI | M70300-50.0 | |
| Orbital Plate Shaker | any | N/A | Capable of running at 220 rpm for at least 96 hours |
| Petri Dishes | any | N/A | 50 mL total volume |
| Reservoirs | any | N/A | |
| Spectrophotometer | any | N/A | |
| Standard Hole Punch | any | N/A | Approximately 7mm punch diameter |
| Sterile water | any | N/A | |
| Surgical Tape | 3M | MMM1538-1 | |
| Teflon Mesh | McMaster-Carr | 1100t41 | |
| Ultrasonicator | any | N/A | |
| Vortex Mixer | any | N/A | |
| X-gal | GoldBio | x4281c | other vendors available |
| Suggested Materials | |||
| 24 Prong Ultrasonicator attachment | any | N/A | For sonicating multiple samples at once. Can be done individually |
| Alumaseal II | Excel Scientific | FE124F | |
| Glass beads | any | N/A | |
| Multipetter/Repetter | any | N/A | |
| Sterile 96-well plates | any | N/A | For serial dilutions. Can be replaced by eppendorf tubes |
| Biological Materials Used | |||
| Arabidopsis thaliana seeds | any | N/A | We recommend Arabidopsis Biological Resource Center for seed stocks |
| Arthrobacter nicotinovorans | Levy, et al. 2018 | ||
| Curtobacterium oceanosedimentum | Levy, et al. 2018 | ||
| Microbacterium oleivorans | Levy, et al. 2018 | ||
| Pseudomonas simiae WCS417r | Published in a similar system in Haney, et al. 2015. Strain used developed in Cole, et al. 2017 |
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