부동 수경 시스템에서 애기장대 뿌리에 세균 식민지화 및 유지 보수 모니터링
Summary
여기에서 우리는 종의 존재를 정량화하고 식물 뿌리의 초기 식민지 동안 다른 성장 환경으로의 전송 후 박테리아의 공간 분포를 시각화하는 수경 식물 성장 분석방법을 설명합니다.
Abstract
박테리아는 미생물, 더 큰 유기체 및 비생물적 환경을 상호 작용하여 형성된 복잡한 뿌리 구 미생물군유전체를 형성합니다. 실험실 조건 하에서, 식물 성장 촉진 박테리아에 의해 뿌리 구 식민지 (PGPB) 건강 또는 식민지화 되지 않은 식물에 비해 호스트 식물의 개발을 증가 시킬 수 있습니다. 그러나, 필드 설정에서, PGPB와 세균 성 치료 종종 작물에 상당한 혜택을 제공 하지 않습니다. 한 가지 설명은 이것이 식물의 수명 동안 내인성 토양 미생물과의 상호 작용 중에 PGPB의 손실때문일 수 있다는 것입니다. 대부분의 연구는 뿌리 구 지역 사회 내에서 PGPB의 유지 보수보다는 초기 식민지에 초점을 맞추고 있기 때문에이 가능성을 확인하기 가 어려웠습니다. 세균 공동체의 어셈블리, 공존 및 유지보수는 뿌리구 미세 환경의 결정적 특징에 의해 형성되며, 이러한 상호 작용이 네이티브 설정에서 PGPB 생존에 영향을 미칠 수 있다는 가설이 있습니다. 이러한 행동을 연구하기 위해, 수경 식물 성장 분석은 애기장대 탈리아나를 사용하여 식물 뿌리의 초기 식민지화 및 다른 성장으로 이동 한 후 박테리아의 공간 분포를 정량화하고 시각화하도록 최적화됩니다. 환경. 이 시스템의 재현성과 유틸리티는 잘 연구 된 PGPB 슈도모나스 시미아에로검증됩니다. 여러 세균 종의 존재가 식물 뿌리에 식민지 및 유지 보수 역학에 영향을 미칠 수있는 방법을 조사하기 위해, 세 가지 세균 균주에서 모델 커뮤니티 (관절염, Curtobacterium,및 Microbacterium 종) 원래 A. 탈리아나 뿌리 줄기에서 분리된다. 이 다양한 세균 종의 존재는 시퀀싱 기반 의 세균 공동체 연구에 대한 대안을 제공하는이 수경 식물 – maintanence 분석기를 사용하여 측정 할 수 있음을 보여준다. 이 시스템을 사용 하 여 미래 연구 시간이 지남에 따라 및 변화 하는 환경 조건에서 다종 식물 미생물군유전체에서 세균 행동의 이해를 향상 시킬 수 있습니다.
Introduction
세균 및 곰팡이 질병에 의한 작물 파괴는 식량 생산을저하시키고 심각하게 글로벌 안정성을 방해 할 수 있습니다 1. 억제 토양에 있는 미생물이 식물 건강을 증가시키는 책임있다는 발견에 근거하여 2, 과학자는 식물 microbiome가 특정의 존재 그리고 풍부를 수정해서 식물 성장을 지원하기 위하여 이용될 수 있는지 물었습니다 세균 종3. 식물 성장 또는 개발에 도움이 발견 하는 박테리아는 집합적으로 식물 성장 촉진 박테리아 라고 (PGPB). 최근에는 잠재적인 PGPB를 식별하는 것에서 부터 토양, 뿌리 주변 또는 뿌리줄기(뿌리 표면을 직접 둘러싸고 포함)에서 왕국 간 상호 작용이 PGPB에 영향을 미칠 수 있는 방법을 이해하는 것으로 연구가 전환되었습니다. 활동4.
PGPB에 의한 뿌리줄기 식민지화는 식민지화되지 않은 식물에 비해 다양한 스트레스에 반응하여 숙주 식물의 건강 또는 발달을 증가시킬 수있다5. 그러나, 결과는 종종 밀접하게 제어 온실 및 실험실 설정에서 관찰 된것과 비교하여 네이티브 토양 조건에서 더 많은 변수 6. 이러한 차이에 대한 하나의 가설은 PGPB의 성장 또는 행동이 필드7,8에서토착 토양 박테리아 또는 곰팡이에 의해 억제될 수 있다는 것이다. 근위대권 박테리아에 의한 유익한 효과는 일반적으로 1) 박테리아의 능력에 따라 달라집니다 1) 뿌리를 찾아 이동, 2) 생물막 형성을 통해 뿌리를 식민지화, 3) 소분자의 생산을 통해 숙주 식물 이나 병원체와 상호 작용 대사 산물7,9. 이러한 식민지화 동작 중 어느 것이든 인접 미생물10의존재 및 활성에 의해 영향을 받을 수 있다.
우리는 뿌리 골격의 이러한 뚜렷한 세균 식민지화 단계를 정량화하고시각화하는 시스템을 설계했습니다(그림 1). 이 접근법은 사전 접종 된 묘목을 심는 동안과 같은 새로운 환경으로 식물을 옮긴 후 장기 PGPB 유지 보수가 때때로 관찰되지 않는 이유를 조사하는 연구를 용이하게합니다. 애기장대는 실험실 연구에서의 광범위한 사용뿐만 아니라 미생물 상호작용에 대해 이용 가능한 충분한 데이터로 인해 식물 모델로 선택되었다11. 시스템에는 3단계가 있습니다: 1) A. 탈리아나 성장, 2) 세균 식민지화 및 3) 세균 유지(도 1참조). A. 탈리아나는 육상 식물이기 때문에 수경 시스템에서 과도한 물 스트레스를 받지 않도록 하는 것이 중요했습니다12. Haney et al.13에서사용하는 방법에서 영감을 얻은 모종은 플라스틱 메쉬상에서 재배되어 액체 성장 배지로부터 촬영을 분리합니다. 이 시스템은 식물 숙주들의 건강과 발달을 손상시키는 것으로 보이지 않으며, 액체11에서 A. 탈리아나 성장을 향상시킨다. 식물 촬영 표면 위에 떠, 뿌리는 완전히 액체 세균 성장 매체에 접종 박테리아에 의해 식민지에 노출. 이 성장에 가장 도움이 되는 영양소에 식민지에 대 한 검사 관심의 박테리아를 허용, 다음 식물의 성장을 지원 하도록 설계 된 영양소 매체에서 성장을 계속 할 수 있도록 조건을 이동 하는 동안. 두 단계 모두 루트13의무산소증을 방지하기 위해 꾸준한 흔들림을 포함합니다. 박테리아는 식민지 배지 또는 유지 매체로부터의 전달 에 따른 식물 뿌리로부터 가시화 또는 정량화될 수 있다. 이 수경 시스템은 매우 유연하여 실험 조건과 적용 된 응력을 연구자의 관심사에 따라 쉽게 변경할 수 있습니다.
이 설명 된 방법은 식물-미생물 상호 작용에 대 한 문학의 큰 몸의 맥락에서 중요 한 또한 성장 환경 설정에 사용자 지정 되 고 있는 동안 루트 표면에서 이러한 상호 작용을 공부 하기 위한 강력한 시스템을 제공 하기 때문에 다른 박테리아. 식물 생물학 실험실은 종종 고체 한천에 식물 미생물 식민지 화 실험을 수행, 또한 후속 전송 하는 동안 식물의 잠재적으로 파괴적인 조작을 요구 하는 동안 박테리아의 평면 운동 (그 경우)에 대 한 허용. 대조적으로, 미생물학 실험실은 수시로 식물14,15의해로, 그들의 실험 내의 박테리아의 건강을 우선순위를 정했습니다. 식물-미생물학 중심의 실험실의 이러한 상이한 우선순위는 역사적으로 이들 그룹 들 간의 결과를 비교하는 것을 어렵게 만들었는데, 이는 각 그룹이 전형적으로 관심 있는 유기체를 최적화하기 위해 실험 조건을 최적화하기 때문이다15. 여기에 설명된 플로팅-메쉬-식물-성장 시스템은 이전 미생물학 지향 연구에서 주목할 만한 이점인 전체 식물 침수를 방지하는 동시에 일시적으로 박테리아의 성장과 생존을 최적화하여 식민지화를 용이하게 합니다. 따라서, 우리가 여기에 제시하는 분석은 미생물학자의 기준을 만족시키면서 (식물의 과잉 수화 및 촉각 조작에 대한) 두 식물 생물학자의 우려를 해결할 수 있습니다 (다른 세균 성장 조건 및 다중 허용) 종 ‘상호 작용)7. 이 프로토콜은 다양한 박테리아, 식물 및 환경 조건에 맞게 조정할 수 있도록 설계되었습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
모든 환경에서 식물은 다른 박테리아와 곰팡이의수백만에 수천 상호 작용 5,7. 이러한 상호 작용 은 작물 수확량 과 식품 생산에 잠재적 인 영향과 함께, 식물 건강에 부정적인 긍정적 인 영향을 미칠 수 있습니다. 최근 연구는 또한 PGPBs에 의한 작물의 가변 식민지화가 현장 실험22에서예측할 수없는 식물 크기와 작물 수확량을 설명 할 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 에너지 생물 환경 연구부 (DOE-BER 0000217519에서 E.A.S.), 국립 과학 재단 (INSPIRE IOS-1343020 – E.A.S)에서 제공하는 연구 기금에 의해 지원되었습니다. SLH는 또한 국립 과학 재단 대학원 연구 펠로우십 프로그램에 의해 지원되었다. 제프리 당들 박사님은 세균균과 귀중한 통찰력을 제공해 주신 것에 대해 감사드립니다. 앤드류 클라인 박사와 매튜 제이 파워스 박사에게 실험적인 제안에 감사드립니다. 마지막으로, SLH는 과학을 전파하는 것은 특권과 책임, 특히 창의적이고 접근 가능한 수단을 통해 우리에게 상기시켜 준 소셜 미디어의 연결에 감사드립니다.
Materials
| Required Materials | |||
| 1.5 mL eppendorf tubes | any | N/A | |
| 24-well plates | BD Falcon | 1801343 | |
| Aeraseal | Excel Scientific | BE255A2 | |
| Autoclave | any | N/A | |
| Bacteria of Interest | any | N/A | Stored at -80˚C in 40% glycerol preferred |
| BactoAgar | BD | 2306428; REF 214010 | |
| bleach | any | N/A | |
| Conviron | any | N/A | Short Day Light-Dark Cycles: 460-600 µmoles/m²/s set at 9/15 hours light/dark at 18/21˚C, with inner power outlet |
| Dessicator Jar: glass or heavy plastic | any | N/A | |
| Ethanol | any | N/A | |
| Flame | any | N/A | |
| Forceps | any | N/A | |
| Incubator | any | N/A | At optimal temperature for growth of specified bacteria |
| Hydrochloric Acid | any | N/A | |
| Lennox LB Broth | RPI | L24066-1000.0 | |
| Microcentrifuge | any | N/A | |
| Micropipetters | any | N/A | Volumes 5 µL to 1000 µL |
| Microscope (preferably fluorescence) | any | N/A | Could be light if best definition not important |
| MS Salts + MES | RPI | M70300-50.0 | |
| Orbital Plate Shaker | any | N/A | Capable of running at 220 rpm for at least 96 hours |
| Petri Dishes | any | N/A | 50 mL total volume |
| Reservoirs | any | N/A | |
| Spectrophotometer | any | N/A | |
| Standard Hole Punch | any | N/A | Approximately 7mm punch diameter |
| Sterile water | any | N/A | |
| Surgical Tape | 3M | MMM1538-1 | |
| Teflon Mesh | McMaster-Carr | 1100t41 | |
| Ultrasonicator | any | N/A | |
| Vortex Mixer | any | N/A | |
| X-gal | GoldBio | x4281c | other vendors available |
| Suggested Materials | |||
| 24 Prong Ultrasonicator attachment | any | N/A | For sonicating multiple samples at once. Can be done individually |
| Alumaseal II | Excel Scientific | FE124F | |
| Glass beads | any | N/A | |
| Multipetter/Repetter | any | N/A | |
| Sterile 96-well plates | any | N/A | For serial dilutions. Can be replaced by eppendorf tubes |
| Biological Materials Used | |||
| Arabidopsis thaliana seeds | any | N/A | We recommend Arabidopsis Biological Resource Center for seed stocks |
| Arthrobacter nicotinovorans | Levy, et al. 2018 | ||
| Curtobacterium oceanosedimentum | Levy, et al. 2018 | ||
| Microbacterium oleivorans | Levy, et al. 2018 | ||
| Pseudomonas simiae WCS417r | Published in a similar system in Haney, et al. 2015. Strain used developed in Cole, et al. 2017 |
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